生姜醇提取物对大鼠肝脏缺血再灌注损伤后细胞凋亡和炎症反应的影响

姜卫星

(冀中能源峰峰集团有限公司总医院，河北 邯郸 056200)



生姜醇提取物对大鼠肝脏缺血再灌注损伤后细胞凋亡和炎症反应的影响

姜卫星

(冀中能源峰峰集团有限公司总医院，河北 邯郸 056200)

[摘要]目的观察生姜醇提取物对肝脏缺血再灌注大鼠炎症反应和肝细胞凋亡的影响。方法将84只SD大鼠随机分为假手术组，模型组，生姜醇提取物100 mg/kg、200 mg/kg、400 mg/kg预处理组和金纳多4 mg/kg预处理组，每组14只。自术前2周开始，各给药组均灌胃给予相应药物，假手术组和模型组灌胃生理盐水，均每天1次。末次灌胃后第2天，除假手术组外，其余组均通过夹闭肝门静脉和肝动脉的方法制备肝脏缺血再灌注模型，再灌注2 h后，测定血清谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、碱性磷酸酶(ALP)水平及炎症因子C反应蛋白(CRP)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素(IL)-1β、IL-6、IL-10水平， HE染色观察肝脏组织病理性形态，TUNEL染色观察肝细胞凋亡情况并计算凋亡指数，检测肝脏组织中超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)活性和丙二醛(MDA)含量，Western blot法检测肝组织中NF-κB蛋白表达并进行半定量分析。结果与模型组比较，生姜醇提取物200 mg/kg、400 mg/kg预处理组大鼠血清ALT、AST、ALP及CRP、TNF-α、IL-6水平均明显降低(P均<0.05)，其中400 mg/kg预处理组IL-1β水平显著降低而IL-10水平显著升高(P均<0.05)。生姜醇提取物各预处理组大鼠肝脏组织病变和肝细胞凋亡状况呈不同程度改善，其中以400 mg/kg预处理组效果最为显著；肝脏组织中SOD、CAT活性显著升高而MDA含量显著降低(P均<0.05)，肝细胞凋亡指数和NF-κB蛋白表达量均显著降低(P均<0.05)。结论生姜醇提取物对大鼠肝脏缺血再灌注后细胞凋亡和炎症反应具有抑制作用；作用机制可能与生姜醇提取物能够有效改善抗氧化酶活性、降低氧化应激损伤、下调NF-κB蛋白表达有关。

[关键词]生姜醇提取物；肝脏；缺血再灌注；炎症；凋亡

肝脏手术过程中经常需要暂时阻断血流以减少出血，但恢复血流再灌注后往往引发肝脏组织的进一步损伤[1]，即缺血再灌注损伤。近年来研究发现炎症反应和细胞凋亡是缺血再灌注损伤的重要病理基础[2]，为临床上防治缺血再灌注损伤提供了新的思路。生姜性味辛温，具有解表散寒、温中止呕、行水解毒之功效，为我国常用的传统中药之一。近年来研究发现，生姜具有抗凋亡和抑制炎症反应的生物学活性[3]。本实验通过采用夹闭肝门静脉和肝动脉后松夹的方法成功制备肝脏缺血再灌注大鼠模型，研究了生姜醇提取物对肝脏缺血再灌注大鼠炎症反应和肝细胞凋亡的影响，现将研究结果报道如下。

1实验资料

1.1实验动物SPF级雄性SD大鼠84只，体质量220～260 g，由河北省实验动物中心提供，许可证号：SCXK(冀)2008-1-003。

1.2药物与试剂生姜醇提取物(陕西旭煌植物科技有限公司，批号：140728，纯度≥90%)；超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)和丙二醛(MDA)检测试剂盒购自南京建成生物工程研究所；C反应蛋白(CRP)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素(IL)-1β、IL-6、IL-10酶联免疫(ELISA)检测试剂盒购自美国密理博公司；谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)和碱性磷酸酶(ALP)检测试剂盒购自深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司；TUNEL染色试剂盒购自北京博奥森生物科技有限公司；NF-kB单克隆抗体购自南京建成生物工程研究所。

1.3主要仪器UV1800 紫外可见光分光光度计(上海菁华科技仪器有限公司)；BS200生化分析仪(深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司)；WD-2102A型全自动酶标仪(北京六一生物科技有限公司)；CUT4062型石蜡切片机(德国SLEE公司)；DYY-11 型多用电泳仪、JY-SCZ2电泳槽(北京六一仪器厂)。

1.4方法

1.4.1动物分组与模型制备将84只SD大鼠随机分为假手术组，模型组，生姜醇提取物100 mg/kg、200 mg/kg、400 mg/kg预处理组和金纳多4 mg/kg预处理组，每组14只。自术前2周开始，生姜醇提取物100 ng/kg、200 mg/kg、400 mg/kg预处理组及金钠多4 mg/kg预处理组均灌胃给予相应药物，假手术组和模型组灌胃等体积生理盐水，均每天1次。末次灌胃后第2天，除假手术组外，其余组均通过夹闭肝门静脉和肝动脉的方法[4]制备肝脏缺血再灌注模型，假手术组行手术通路，但不阻断肝门静脉和肝动脉。缺血1 h再灌注2 h后，经腹主动脉取血，并取肝脏组织标本，-20 ℃保存待测。

1.4.2血清ALT、AST、ALP水平检测各组大鼠取血液标本，经2 000 r/min离心5 min后取上层血清，根据试剂盒操作说明，通过全自动生化检测仪测定各组大鼠血清ALT、AST、ALP水平。

1.4.3血清CRP、TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10水平测定取血液标本，置于冰上缓慢解冻后，根据ELISA试剂盒操作说明，通过全自动酶标仪测定各组大鼠血清CRP、TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10水平。

1.4.4肝脏组织病理形态学观察取肝脏组织标本，置于4%多聚甲醛固定液中进行固定，经石蜡包埋、切片(厚度约5 μm)和展片处理后，行常规HE染色，于倒置光学显微镜下观察肝脏组织病理形态学改变。

1.4.5肝细胞凋亡状况的观察及凋亡指数的计算取1.4.4步骤制备的肝脏组织石蜡切片，进行TUNEL染色，然后在光学显微镜下观察肝细胞凋亡状况(黄褐色细胞为阳性着色细胞)。每张染色切片随机选取6个视野，分别计数每个视野中细胞总数和阳性着色细胞数，各组分别取平均值，然后计算肝细胞凋亡指数：凋亡指数(%)=阳性细胞数/细胞总数×100%。

1.4.6肝脏组织中SOD、CAT活性和MDA含量检测每组随机取7只大鼠的肝脏组织，研磨匀浆，3 000 r/min离心10 min后取上清液，严格按照试剂盒操作步骤测定各组大鼠肝脏组织中SOD、CAT活性和MDA含量。

1.4.7肝脏组织NF-κB蛋白表达的检测及半定量分析取1.4.6步骤每组剩余大鼠的肝组织匀浆上清液，采用BCA法进行蛋白定量，变性后上样、电泳，待溴酚蓝接近胶底部时停止、转膜、春红溶液染色，室温下5%脱脂奶粉封闭2 h，一抗(NF-κB，β-actin)4 ℃过夜；洗膜，二抗室温摇床上孵育1 h后经ECL显色，实验结果应用Quantity One软件进行分析。

2结果

2.1各组大鼠血清ALT、AST、ALP水平比较模型组大鼠血清ALT、AST、ALP水平均明显高于假手术组(P均<0.05)；生姜醇提取物200 mg/kg、400 mg/kg预处理组和金纳多4 mg/kg预处理组血清ALT、AST、ALP水平均明显低于模型组(P均<0.05)。见表1。

2.2各组大鼠血清CRP、TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10水平比较模型组大鼠血清中CRP、TNF-α、IL-1β、IL-6水平均明显高于假手术组(P均<0.05)， IL-10水平明显低于假手术组(P<0.05)；生姜醇提取物200 mg/kg、400 mg/kg预处理组血清CRP、TNF-α、IL-6水平均明显低于模型组(P均<0.05)，其中400 mg/kg预处理组IL-1β水平明显低于模型组(P<0.05)，IL-10水平明显高于模型组(P<0.05)。见表2。

表1　各组大鼠血清ALT、AST、ALP水平比较

注：①与假手术组比较，P<0.05；②与模型组比较，P<0.05。

2.3各组大鼠肝脏组织结构形态学表现假手术组大鼠肝脏组织结构及肝细胞形态均未见异常；模型组大鼠肝组织纹理不清，肝窦充血，部分肝小叶结构模糊，肝细胞呈空泡变性和坏死，胞核固缩并深染；而各给药组肝脏组织病理形态学改变明显改善，其中以生姜醇提取物400 mg/kg预处理组效果最为显著。见图1～6。

表2　各组大鼠血清CRP、TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10水平比较

注：①与假手术组比较，P<0.05；②与模型组比较，P<0.05。

图1　假手术组大鼠肝脏组织病理形态学表现

图2　模型组大鼠肝脏组织病理形态学表现

2.4各组大鼠肝脏组织TUNEL染色表现模型组大鼠肝细胞凋亡数量较假手术组明显增多；而各给药组大鼠肝细胞凋亡状况明显改善，其中以生姜醇提取物400 mg/kg预处理组效果最为显著，见图7～12。假手术组大鼠肝细胞凋亡指数为(2.6±1.4)%，模型组为(37.5±6.9)%，生姜醇提取物100 mg/kg、200 mg/kg、400 mg/kg预处理组分别为(30.2±7.0)%、(24.1±5.4)%、(14.7±4.2)%，金纳多4 mg/kg预处理组为(26.9±5.5)%。模型组大鼠肝细胞凋亡指数明显高于假手术组(P<0.05)，而生姜醇提取物200 mg/kg、400 mg/kg预处理组和金纳多4 mg/kg预处理组均明显低于模型组(P均<0.05)。

图4　生姜醇提取物200 mg/kg预处理组大鼠肝脏

图5　生姜醇提取物400 mg/kg预处理组大鼠肝脏

图6　金纳多4 mg/kg预处理组大鼠肝脏组织病理形态学表现

图7　假手术组大鼠肝细胞凋亡表现

图8　模型组大鼠肝细胞凋亡表现

图9　生姜醇提取物100 mg/kg预处理组大鼠肝细胞凋亡表现

图10　生姜醇提取物200 mg/kg预处理组大鼠肝细胞凋亡表现

图11　生姜醇提取物400 mg/kg预处理组大鼠肝细胞凋亡表现

图12　金纳多4 mg/kg预处理组大鼠肝细胞凋亡表现

2.5各组大鼠肝脏组织中SOD、CAT活性和MDA含量比较模型组大鼠肝脏组织中SOD、CAT活性明显低于假手术组(P均<0.05)，MDA含量明显高于假手术组(P<0.05)；生姜醇提取物200mg/kg、400 mg/kg预处理组SOD、CAT活性均明显高于模型组(P均<0.05)，MDA含量均明显低于模型组(P均<0.05)。见表3。

2.6各组大鼠肝脏组织NF-κB蛋白表达量比较假手术组、模型组、生姜醇提取物100 mg/kg、200 mg/kg、400 mg/kg预处理组和金纳多4mg/kg预处理组肝脏组织NF-κB蛋白相对表达量分别为0.15±0.04，0.42±0.13，0.37±0.12，0.32±0.09，0.26±0.08，0.30±0.10。模型组大鼠肝脏组织中NF-κB蛋白相对表达量明显高于假手术组(P<0.05)，而生姜醇提取物200 mg/kg、400 mg/kg预处理组和金纳多4 mg/kg预处理组的NF-κB蛋白表达量均明显低于模型组(P均<0.05)。各组大鼠肝脏组织中NF-κB蛋白表达量电泳图见图13。

表3　各组大鼠肝脏组织中SOD、CAT活性和MDA含量比较±s)

注：①与假手术组比较，P<0.05；②与模型组比较，P<0.05。

A为假手术组；B为模型组；C为生姜醇提取物100 mg/kg预处理组；

3讨论

肝脏缺血再灌注损伤是影响肝脏手术预后、损伤肝功能的危险因素之一。近年来，随着病理生理机制研究的深入，发现炎症反应及其继发的细胞凋亡是其重要的发病原因之一。华晨等[5]和齐艳艳等[6]研究发现，通过抑制炎症反应、改善肝细胞凋亡能够有效缓解肝脏缺血再灌注损伤。

肝脏组织中脂质过氧化终产物MDA含量能够间接反映肝细胞膜受氧化应激损伤程度[7]； SOD能够提供氢原子配体而催化还原氧自由基生成过氧化氢[8-9]，并在CAT的作用下进一步还原生成对人体无害的水和氧[10]，因此SOD和CAT的活性能够反映机体抗氧化能力水平。血清中ALT、AST和ALP水平是反映肝功能及肝细胞损伤程度的重要指标，正常情况下，血液中ALT、AST含量都非常低，当细胞膜系统受氧自由基攻击而受损时，它们将迅速释放入血，使血清中含量陡然增高，因此血清中三者的水平能够非常敏感地反映肝脏组织受损伤程度，而血清中CRP、TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10水平是临床上用来监测体内炎症反应的常用指标。

细胞凋亡是一种有多种基因参与调控的程序化死亡过程，可由多种因素导致其发生，其中氧化应激损伤是其重要的诱发因素[11]。NF-κB为多效能核转录因子，常态下，NF-κB以无活性形式存在于胞质中；而当细胞受到外界因素刺激时，NF-κB将暴露出核定位信号并进入胞核内，调控靶基因的转录与表达。Zhang等[12]研究发现，NF-κB激活能够对抗氧化应激诱导的心肌细胞凋亡，证实NF-κB激活与氧化应激诱导的心肌细胞凋亡密切相关。

生姜为姜科植物姜的新鲜根茎，现代药理学研究发现，其提取物具有良好的抗氧化活性。本研究发现生姜醇提取物能够有效降低血清中炎症因子水平，改善抗氧化酶活性，抑制氧化应激损伤，改善肝脏组织病变，降低NF-κB蛋白表达水平，抑制肝细胞凋亡，提示生姜醇提取物对大鼠肝脏缺血再灌注损伤后肝脏细胞亡凋和炎症反应具有抑制作用。

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Effect of ethanol extract of zingiber officinale against inflammation and hepatocyte apoptosis after hepatic ischemia-reperfusion injury in rats

JIANG Weixing

(Jizhong Energy Fengfeng Group Hospital, Handan 056200, Hebei, China)

Abstract:Objective It is to observe the influence of ethanol extract of zingiber officinale against inflammation and hepatocyte apoptosis after hepatic ischemia-reperfusion injury in rats. Methods 84 SD rats were randomly divided into five groups: sham operation group, ischemia-reperfusion control group, ethanol extract of zingiber officinale (100, 200, 400 mg/kg) dose per-treated groups and Ginaton 4 mg/kg per-treated group, 14 cases in each group. Two weeks before operation, the animals were treated with corresponding drug or normal saline by intragastric administration, once a day. Second days after the last irrigation stomach, except the sham operation group, the hepatic ischemia reperfusion models in the other groups were made by occlusion of hepatic portal vein and hepatic artery. Two hours after reperfusion, the content of ALT, AST, ALP, CRP, TNF-α, IL-1β, IL-6, IL-10 in plasma were detected, the histopathological changes were observed by HE staining, the activity of SOD, CAT and the content of MDA were determined; the hepatocyte apoptosis were observed by TUNEL staining, and the apoptosis (AI) was calculated; the expression of NF-κB protein was detected by Western blot and semi-quantitative analysis. Results Compared with the ischemia-reperfusion control group, the contents of CRP, TNF-α, IL-6 in plasma of ethanol extract of zingiber officinale 200, 400 mg/kg dose per-treated groups were significantly decreased (all P<0.05); the content of IL-1β was significantly decreased and the content of IL-10 was significantly increased in ethanol extract of zingiber officinale 100 mg/kg dose per-treated group (all P<0.05). The activity of SOD, CAT were significantly increased and the content of MDA was significantly decreased in ethanol extract of zingiber officinale per-treated groups, the histopathological changes and the hepatocyte apoptosis were significantly improved, the AI and the expression of NF-κB proten were significantly down-regulated (all P<0.05). Conclusion The ethanol extract of zingiber officinale has inhibition effects against inflammation and hepatocyte apoptosis after hepatic ischemia-reperfusion injury in rats; which perhaps relate to its effects of improve the activity of antioxidase, and reduce the damage of free radical, and down-regulate the expression of NF-κB proten.

Key words:ethanol extract of zingiber officinale; liver; ischemia-reperfusion; inflammation; apoptosis

[收稿日期]2015-10-30

[中图分类号]R-332

[文献标识码]A

[文章编号]1008-8849(2016)09-0932-06

doi:10.3969/j.issn.1008-8849.2016.09.007

[作者简介]姜卫星，男，主治医师，从事普通外科临床研究工作。