针刺结合音乐疗法对焦虑模型大鼠海马Glu/GABA兴奋/抑制平衡系统的影响

郑　蔚,赵日霞,刘海静

(云南中医学院针灸推拿康复学院，云南 昆明 650500)



针刺结合音乐疗法对焦虑模型大鼠海马Glu/GABA兴奋/抑制平衡系统的影响

郑蔚,赵日霞,刘海静

(云南中医学院针灸推拿康复学院，云南 昆明 650500)

[摘要]目的通过观察针刺结合音乐疗法对焦虑模型大鼠海马谷氨酸(Glu)、γ-氨基丁酸(GABA)含量和二者比值的影响，探讨此方法的部分抗焦虑机制。方法将50只雄性SD大鼠随机分为空白组、模型组、针刺组、音乐组和针刺音乐组，每组10只。除空白组外，其余组大鼠均给予连续21 d不可预见性的刺激，同时针刺组、音乐组及针刺音乐组在每次刺激前1 h给予相应的针灸及音乐干预。实验结束后取各组大鼠的海马，采用高效液相色谱检测法分析各组样本中Glu和GABA含量。结果模型组大鼠海马Glu含量及Glu/GABA比值均明显高于空白组(P均<0.05)，GABA含量明显低于空白组(P<0.05)。针刺组和针刺音乐组Glu含量及Glu/GABA比值均明显低于模型组(P均<0.05)，针刺组、音乐组和针刺音乐组GABA含量均明显高于模型组(P均<0.05)，针刺组和针刺音乐组各指标比较差异均无统计学意义(P均>0.05)。结论针刺结合音乐疗法抗焦虑作用与其海马Glu/GABA平衡有关。

[关键词]焦虑；针刺疗法；音乐疗法；谷氨酸；γ-氨基丁酸；海马；大鼠

焦虑症已成为现代社会常见的精神类疾病，虽其病因和发病机制尚未完全明了，但有研究表明，神经递质间的失平衡是导致焦虑症发病的重要机制之一[1]。谷氨酸(Glu)/γ-氨基丁酸(GABA)的平衡对于维持神经细胞抑制与兴奋功能平衡的稳定具有极为重要的作用。许多学者认为，神经网络这个稳态平衡被打破，就可能产生焦虑、抑郁、双相情感障碍等精神类疾病[2]。针对焦虑症，现代医学主要使用抗焦虑药物进行治疗，但因其有耐药性、成瘾性以及较大的不良反应，导致患者依从性较差，从而严重影响了临床疗效。近几年，大量临床研究显示针灸对于焦虑障碍有确切的疗效[3-5]。而音乐治疗能改善患者的焦虑、抑郁情绪，增强主动性，对症状的改善起一定作用[6]。本研究对照观察了针刺疗法、音乐疗法和针刺结合音乐疗法干预后焦虑模型大鼠海马Glu、GABA含量和Glu/GABA比值的变化，以探讨上述疗法抗焦虑的机制，现将结果报道如下。

1实验资料

1.1实验动物选用SD雄性大鼠60只,体质量180～220 g，动物及饲料均由云南中医学院实验动物研究所提供,合格证号:No.0018163。实验室温度保持在(23±2)℃,湿度70%～80%,安静。动物在实验前置于7:00—19:00光照、19:00—7:00黑暗的实验室中适应性驯养7 d,动物自由进食、饮水。

1.2主要实验仪器及试剂高架十字迷宫( elevated plus- maxe, EPM) 和旷场实验(Open-field test)均采用国际通用方法自制；日本岛津LC-20A高效液相色谱仪，包括在线脱气机DGU-20A3R(C)、二元泵LC-20AB、自动进样器SIL-20A、柱温箱CTO-20A、检测器SPD-20A；H1650R型湘仪台式高速冷冻离心机；GABA和Glu标准品，批号为20120322和140624-200805，分别为上海源叶生物科技有限公司和中国药品生物制品检定所产品；色谱乙腈和色谱甲醇为美国Sigma公司产品；Thermo Scientific Hypersil GOLD C18色谱柱为美国Thermo Scientific公司产品。

1.3动物分组及处理方法驯养7 d后，通过旷场实验将垂直运动次数和水平运动次数相加次数不足30次或超过120次的大鼠剔除后[7]进行编号，查随机数字表分为空白组、模型组、针刺组、音乐组和针刺音乐组，每组10只。于第8天起，除空白组外，其余组动物均采用不可预知慢性情绪应激(CES)刺激的方法复制焦虑模型[8-9]，即接受连续21 d不可预见性刺激，包括电击足底、禁水1 h、禁食1 h、24 h光照、24 h黑暗、两笼混为一笼、单笼、倾斜、从两笼各抓1～2只混笼共9种应激刺激，用SPSS 16.1统计软件包transform将此9种刺激随机分配到21 d中，每天安排1种应激刺激。自实验第1天起，模型组给予上述造模刺激；针刺组参照《实验针灸学》[10]大鼠穴位定位，取百会、内关、三阴交，采用针身长度为2 mm的32号麦粒型皮内针针刺百会，针身长度为5 mm的32号图钉型皮内针针刺内关和三阴交，每次留针30 min，1次/d，每次干预结束1 h后对大鼠进行造模刺激；音乐组将大鼠置于黑暗密闭空间，用录音机播放音乐45 min，1 h后进行造模刺激；针刺音乐组大鼠进行针刺治疗留针期间进行音乐治疗，治疗结束1h后进行造模刺激。

1.4GABA及Glu指标检测

1.4.1取材及处理干预21 d后，大鼠经7%水合氯醛350 mg/kg腹腔注射麻醉后，迅速断头取出全脑，冰上分离出海马，称质量；加入预冷的生理盐水，冰上电动匀浆(25 000 r/min，10 s)，匀浆液经4 ℃离心(12 000 r/min)20 min，取上清，加3倍体积乙腈，混匀后经4 ℃离心(12 000 r/min)10 min沉淀变性蛋白，取1 mL上清液于离心管中(剩余上清液先置于-20 ℃预冷24 h，而后置于-80 ℃冰箱保存备用)，用带孔封口膜封住离心管口，自然挥干，用1 mL甲醇充分溶解后，经0.45 μm滤膜过滤，待测。

1.4.2GLU、GABA含量测定方法采用HPLC紫外结合异硫氰酸苯酯(phenyl isothiocyanate, PITC)柱前衍生技术测定。①色谱条件：Hypersil GOLD C18色谱柱，250 mm×4.6 mm ，5 μm；柱温40 ℃。检测波长：254 nm。②流动相包括A液和B液。流动相(A)：称取醋酸钠4.1 g，溶于1 000 mL超纯水中，经0.45 μm滤膜真空抽滤，以20∶1体积加入色谱级甲醇，利用冰乙酸调节pH为5.5，超声脱气20 min，现配现用；流动相(B)：100%乙腈。线性梯度：在0～40 min内，流动相B以线性从0上升到100%。流量：1 mL/min。

2结果

模型组大鼠海马Glu含量及Glu/GABA值均明显高于空白组(P均<0.05)，GABA含量明显低于空白组(P<0.05)。针刺组和针刺音乐组大鼠海马Glu含量及Glu/GABA值均明显低于模型组(P均<0.05)，针刺组、音乐组和针刺音乐组大鼠海马GABA含量均明显高于模型组(P均<0.05)。针刺组和针刺音乐组各指标比较差异均无统计学意义(P均>0.05)。见表1。

表1　各组大鼠海马Glu和GABA含量及比值比较

注：①与空白组比较，P<0.05；②与模型组比较，P<0.05。

3讨论

焦虑症现又称焦虑障碍，指的是以广泛和持续性焦虑或反复发作的惊恐不安为主要特征的神经症性障碍,临床上将其分为广泛性焦虑(GAD)和惊恐障碍(PD)2个类型。焦虑症的发病机制十分复杂，尚不完全明了，近几十年的研究发现，其发生发展与神经递质(如单胺神经递质、γ-GABA、Glu等)、神经肽[促肾上腺皮质激素释放激素(CRF)、神经肽Y(NPY)等]以及相关受体和基因表达的异常等均有关[11-13]。而早有研究表明，中枢4大神经递质去甲肾上腺素(NE)、多巴胺(DA)、5-羟色胺(5-HT)及GABA之间的失平衡是导致焦虑产生的重要机制之一[14-15]。海马、大脑皮质等边缘结构单胺类神经递质的异常升高均可引起焦虑情绪的产生[16-17]。Glu是中枢神经系统中重要的兴奋性神经递质，生理浓度的Glu对于维持细胞的正常生理活动是必需的，如果Glu浓度和作用时限超出生理范围，则会产生兴奋性神经毒性，损伤神经元。而GABA是脑内主要的抑制性神经递质，其不能透过血脑屏障, 脑组织中的 GABA 均由 Glu 经谷氨酸脱羧酶脱羧而生成,两者代谢的平衡改变可导致中枢神经系统功能改变。

本研究结果显示，焦虑模型大鼠海马Glu含量显著升高，GABA含量显著下降，Glu/GABA显著升高。提示焦虑的形成与海马Glu/GABA平衡失调有关。针刺组和针刺音乐组Glu含量及Glu/GABA比值均显著低于模型组，GABA含量显著高于模型组。音乐组略有下降，但差异无统计学意义。提示针刺疗法或针刺结合音乐疗法均能不同程度下调焦虑模型大鼠升高的海马Glu含量，上调下降的海马GABA含量，从而纠正大鼠海马Glu /GABA 兴奋/抑制系统的失衡状态。其中针刺疗法和针刺结合音乐疗法较单纯音乐疗法对焦虑模型大鼠海马Glu/GABA兴奋/抑制平衡系统的调节作用更为显著，而针刺疗法与针刺音乐疗法的作用差异无统计学意义，提示针刺音乐疗法及针刺疗法对焦虑模型大鼠海马Glu/GABA兴奋/抑制平衡系统的调节作用肯定，而音乐疗法虽然在临床上有一定抗焦虑作用，但对大鼠海马Glu/ GABA 系统影响不显著，这可能与动物对音乐的感受性有关，也可能音乐疗法需要更长的时间和疗程，其更深入的机制尚待进一步研究。

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Study on the effects of acupuncture combined with music therapy on the balance excitatory and inhibitory of hippocampal Glu/GABA in anxiety model rats

ZHENG Wei, ZHAO Rixia, LIU Haijing

(Acupuncture and Massage Rehabilitation College of Yunnan University of TCM, Kunming 650500, Yunnan, China)

Abstract:Objective It is to observe the influence of acupuncture combined with music therapy on the content and ration of Glu/GABA in hippocampus in anxiety model rats, and approach the anti-anxiety mechanism. Methods 50 cases of male SD rats were randomly divided into blank group, model group, acupuncture group, music group and acupuncture combined with music group with 10 rats in each group. Except the blank group, the other animals were used in unpredictable chronic emotional stress method (Chronic Emotional Stress, CES) for 21 days to make anxiety model; at the same time, the animals of music group, acupuncture group, acupuncture combined with music group in 1 hours before each stimulus were gave the corresponding acupuncture or music therapy. After experiment, the hippocampi of rats in each group were extracted to detect the Glu and GABA contents by using high efficiency liquid chromatography. Results Compared with the blank group, the concentration of Glu and the value of Glu/GATA were significantly increased and the concentration of GABA was significantly reduced in the model group (all P<0.05). The concentration of Glu and the value of Glu/GATA of acupuncture group and acupuncture combined with music group were significantly reduced and the concentration of GATA were significantly increased than those of the model group (all P<0.05); but there was no significant difference between acupuncture group and acupuncture combined with music group (all P>0.05). Conclusion Anti-anxiety mechanism of acupuncture combined with music therapy is related to the function of regulating the concentration of Glu/GABA in hippocampus.

Key words:anxiety; acupuncture therapy; music therapy; Glu; GABA; hippocampus; rat

[收稿日期]2015-09-01

[中图分类号]R-332

[文献标识码]A

[文章编号]1008-8849(2016)09-0917-03

doi:10.3969/j.issn.1008-8849.2016.09.002

[基金项目]云南白药、云南中医学院中医药教育创新基金项目(2014011)

[作者简介]郑蔚，女，研究生，研究方向为针灸治疗心身疾病的临床研究。[通信作者]刘海静，E-mail:luckylhj2004@163.com