玉屏风散加味方干预COPD气道重塑相关细胞因子作用研究

程　羽,陈　静,羊忠山,张晓梅,袁嘉丽,陈　雨

(云南中医学院,云南 昆明 650500)



玉屏风散加味方干预COPD气道重塑相关细胞因子作用研究

程羽,陈静,羊忠山,张晓梅,袁嘉丽,陈雨

(云南中医学院,云南 昆明 650500)

目的探讨玉屏风散加味方对慢性阻塞性肺疾病(COPD)气道重塑大鼠基质金属蛋白酶-9(MMP-9)、基质金属蛋白酶抑制剂-1(TIMP-1)和转化生长因子β1(TGF-β1)的调节作用。方法将60只SD大鼠随机分为正常组、模型组、玉屏风散加味方高剂量组、玉屏风散加味方中剂量组、玉屏风散加味方低剂量组、阳性组，每组10只。除正常组外，其余各组大鼠采用被动吸烟加气管内注入LPS的方法复制COPD大鼠模型，玉屏风散加味方各组给予相应剂量玉屏风散加味方灌胃，阳性组给予罗红霉素胶囊溶液灌胃，正常组、模型组给予等量生理盐水灌胃。灌胃30 d后用ELISA方法测定大鼠肺泡灌洗液中MMP-9、TIMP-1、TGF-β1水平，计算MMP-9/TIMP-1比值。结果模型组MMP-9、TIMP-1、TGF-β1表达水平均明显高于正常组(P均<0.05)，MMP-9/TIMP-1比值明显低于正常组(P<0.05)；玉屏风散加味方高、中剂量组及阳性组MMP-9、TIMP-1、TGF-β1表达水平均明显低于模型组(P均<0.05)，玉屏风散加味方高剂量组MMP-9、TIMP-1、TGF-β1表达水平均明显低于玉屏风散加味方低剂量组(P均<0.05)。结论玉屏风散加味方可延缓COPD气道重塑病变，其干预COPD气道重塑的作用可能是通过调节气道局部细胞因子MMP-9、TIMP-1和TGF-β1表达实现的，且以高剂量效果最为明显。

[关键词]玉屏风散加味方；慢性阻塞性肺疾病；气道重塑；基质金属蛋白酶-9；基质金属蛋白酶抑制剂-1；转化生长因子β1

基质金属蛋白酶-9(MMP-9)存在于多种生物体并可表达于多种细胞，能调节降解气道和细胞外基质(ECM)的代谢，其过度表达可使血管内皮生长因子释放，促进新血管的形成，降解血管胶原成分，加速平滑肌细胞移行到血管基质，导致气道重塑的发生发展[1]。基质金属蛋白酶抑制剂-1(TIMP-1)能阻止或延缓酶原型MMP-9转变为激活型MMP-9，减轻MMP-9参与血管内皮生长因子的释放及上皮细胞的移行，从而阻止气道平滑肌细胞肥厚增殖导致的气道重塑[2]。TIMP-1以1∶1的分子比例与MMP-9异性结合形成复合物，从而特异性抑制MMP-9的活性，二者共同维持呼吸道壁破坏与修复间的平衡，参与支气管、肺泡壁进行性破坏和不可逆的呼吸道重塑过程。转化生长因子β1(TGF-β1)可以促进气道平滑肌细胞增殖，使ECM成分合成，引起杯状细胞增生，从而导致气道内黏液分泌增多，刺激蛋白酶抑制剂的产生，从而引起ECM降解减少，沉积增加。有研究认为TGF-β1在肺内支气管形态改变、细胞外基质产生和组织纤维化的过程中具有重要的作用[3]。基于此，本实验试图通过云南名中医李庆生教授临床治疗慢性阻塞性肺疾病(COPD)有效方玉屏风散加味方干预COPD大鼠，探讨该方对COPD病程关键环节气道重塑相关因子MMP-9、TIMP-1和TGF-β1的调节作用，为中医药治疗COPD提供临床思路和实验依据。现报道如下。

1实验资料

1.1实验动物SPF级SD大鼠60只，体质量(200±20 )g，由四川省达硕生物研究所提供(合格证号：0018160；许可证号：scxk(川)2014-23)。

1.2实验材料及仪器脂多糖(LPS)，10 mg/支，临用前与生理盐水配制成0.1%溶液，置4 ℃冰箱保存备用；水合氯醛，临用前与生理盐水配置成10%的溶液；红塔山牌香烟，MMP-9、TIMP-1及TGF-β1ELISA试剂盒(美国RB公司)，手术剪、眼科镊、24G静脉留置针、消毒巾。SPectraMax 340PC型酶标仪，超纯水制备系统(Milli-Q BIOCEL)，-70 ℃超低温冰箱(8525型)，YP型电子天平(上海光正医疗器械有限公司)，台式高速离心机(美国BECKMAN公司)，自制有机玻璃烟熏箱(50 cm×30 cm×40 cm)。

1.3实验用药玉屏风散加味方组方：黄芪18 g、白术12 g、防风15 g、三七9 g、莪术12 g、桑白皮15 g、浙贝母15 g、白芥子15 g，每克生药加水8 mL煎药3次后取滤液，置于4 ℃冰箱冷藏备用。以成人每日治疗剂量根据大鼠体表面积换算为其等效剂量，此剂量作为中剂量实验药物，在此基础上经过浓缩和稀释获得高、中、低剂量，低、中、高剂量的比例为1∶3∶9。阳性药物制备方法：罗红霉素胶囊按成人(60 kg)临床每日用药量即300 mg，每200 g大鼠1 d所需药量=300 mg×0.018=5.4 mg(0.018是根据《中药药理实验方法学》中人与大鼠按体表面积转换系数)，碾碎研磨后用0.9%NaCl溶液配成浓度为5.4 mg/mL的溶液，置于4 ℃冰箱冷藏备用。

1.4实验方法将大鼠随机分为正常组、模型组、玉屏风散加味方高剂量组、玉屏风散加味方中剂量组、玉屏风散加味方低剂量组、阳性组，每组10只。除正常组外，其余各组大鼠采用被动吸烟加气管内注入LPS的方法复制COPD大鼠模型[4]：实验第1，14天腹腔注射10%水合氯醛麻醉后，固定于大鼠解剖台上，暴露颈部，用碘消毒并用75%乙醇脱碘，按照大鼠颈部解剖位置，用1 mL注射器以水平方向15°斜刺进入气管，回抽判断是否刺入，气管内注入LPS 200 μL，实验第2—56天(注射LPS当天除外，造模成功后持续烟熏刺激28 d)上午将大鼠置入自制密闭的有机玻璃箱内，注入红塔山牌香烟烟雾，每次被动吸烟4支，持续30 min/d。正常组采用相同的方法气管内注入等量的生理盐水，不予烟熏。造模28 d后，每组处死2只，各造模组可见支气管管腔明显狭窄，支气管纤毛上皮细胞变性、坏死、脱落；支气管周围可见大量炎性细胞浸润；肺泡结构紊乱，肺泡壁变薄或断裂，肺泡腔扩大，融合成肺大泡。从第29天开始，玉屏风散加味方高、中、低剂量组及阳性组每日给予玉屏风散加味方及罗红霉素胶囊溶液灌胃，按体质量每200 g灌胃2 mL，连续给药28 d；正常组、模型组给予等量生理盐水灌胃。

1.5标本采集及检测方法末次灌胃后24 h，根据曾华东等[5]的实验方法，收集大鼠支气管肺泡灌洗液(BALF)。麻醉各组大鼠后将其置于大鼠手术台，无菌条件下剪开腹腔进行腹主动脉取血，使颈部手术视野干净，防止因出血模糊视野，用手术剪剪开颈部皮肤，钝性分离，暴露出气管和双肺，将1根手术线从气管下穿过，结扎右主支气管，用24G静脉穿刺针插入气管内(注意不要超过气管分叉处)针线结扎，将3 mL生理盐水经留置针缓慢灌入气道内，轻柔按摩肺脏30 s后，来回抽吸共行3次灌洗，用10 mL无菌离心管回收全部的BALF液(回收率>80%)，收集的BALF至于4 ℃ 4 000 r/min离心机离心20 min。离心后收集上清液，置-20 ℃冰箱保存待测。采用双抗体夹心酶联免疫吸附试验(ELISA)检测各组大鼠BALF中MMP-9、TIMP-1和TGF-β1表达水平，严格按照试剂盒说明书操作，用酶标仪在450 nm波长下测定吸光度，计算样品浓度。

2结果

模型组MMP-9、TIMP-1、TGF-β1表达水平均明显高于正常组(P均<0.05)，MMP-9/TIMP-1比值明显低于正常组(P<0.05)；玉屏风散加味方高、中剂量组及阳性组MMP-9、TIMP-1、TGF-β1表达水平均明显低于模型组(P均<0.05)，玉屏风散加味方低剂量组MMP-9、TIMP-1、TGF-β1表达水平与模型组比较差异均无统计学意义(P均>0.05)；玉屏风散加味方高剂量组MMP-9、TIMP-1、TGF-β1表达水平均明显低于玉屏风散加味方低剂量组(P均<0.05)，玉屏风散加味方中剂量组MMP-9、TIMP-1、TGF-β1表达水平与低剂量和高剂量组比较差异均无统计学意义(P均>0.05)。见表1。

3讨论

COPD属于中医学“咳嗽”“喘证”“肺胀”等范畴，中医学认为“肺气虚兼痰瘀”是COPD的基本病机[6-7]。气虚是肺胀的发病基础，亦是COPD气道重塑发生发展的根基。因此，玉屏风散加味方以黄芪、白术为君药。黄芪善入肺经，补益肺、脾之气，脾气健运则津液得布，痰浊自除。白术功善健脾，能培土生金，与黄芪配伍补益肺气之功愈强；又能燥湿有助于脾气运化，杜绝生痰之源，祛除痰浊。防风走表而散风御邪，黄芪得防风则补肺不留邪。瘀血与痰阻是COPD气道重塑进程中非常重要的环节，在疾病发生发展中既是病因，又是病理产物。故用三七、莪术活血逐瘀，为臣药。三七善入血分，长于化瘀生新，有化瘀不伤正、止血不留瘀的特点。莪术既入血分又入气分，能破血散瘀，二者协同增效，逐瘀力强，与黄芪、白术同用，行血不伤血，祛瘀不伤正。同时，以桑白皮、浙贝母、白芥子宣肺降气平喘涤痰为佐药。桑白皮能泄肺中水气而平喘，亦能降泄肺气，通调水道，祛除痰浊；浙贝母长于清热涤痰，降泄肺气；白芥子消皮里膜外之痰。三药相配伍，寒温并用，润燥相结合，有助于痰浊祛除。

表1　各组大鼠细胞因子MMP-9、TIMP-1、MMP-9/TIMP-1、TGF-β1表达水平比较

注：①与正常组比较，P<0.05；②与模型组比较，P<0.05；③与玉屏风散加味方低剂量组比较，P<0.05。

COPD气道重塑早期肺组织以MMP-9的表达增加为主，主要存在于渗出的中性粒细胞(NEU)、肺泡巨噬细胞(AM)和支气管上皮细胞中。MMP-9 除了通过破坏ECM，还破坏肺泡上皮结构，参与炎性反应和气道重塑[8]。炎症反应促使MMP-9 表达增强，MMP-9可使基底膜成分降解，介导单核细胞等穿过血管，在降解的ECM中游走，向靶器官浸润，促进炎症反应及组织损伤，并促使肺泡壁基底膜降解及肺气肿形成。本实验结果表明，正常组大鼠BALF中MMP-9表达水平极少，模型组MMP-9表达水平明显升高，提示MMP-9参与了COPD气道重塑的病变过程。经玉屏风散加味方治疗后MMP-9表达水平下调，尤其以高剂量组的表达水平下调明显，推测玉屏风散加味方通过活血、化瘀等作用抑制MMP-9过高的表达，从而抵抗肺组织纤维化。

TIMP-1 在TIMPs所有亚类中活性最强，它主要由AM、内皮细胞、成纤维细胞合成，并以可溶性的形式分泌到ECM中。TIMP-1以1∶1的分子比例与MMP-9特异性结合形成复合物，从而特异性抑制MMP-9的活性，共同维持呼吸道壁破坏与修复间的平衡，参与支气管、肺泡壁进行性破坏和不可逆的气道重塑构过程。

本实验结果表明，正常组大鼠BALF中TIMP-1表达水平极少，模型组TIMP-1表达水平明显升高，提示COPD气道重塑炎症发生时TIMP-1表达水平升高，且参与COPD的疾病过程。经玉屏风散加味方治疗后TIMP-1表达水平下调，尤其以高剂量组的下调最为明显，表明玉屏风散加味方可下调COPD模型大鼠气道重塑的TIMP-1表达水平。

MMP-9和TIMP-1间的平衡是维持ECM正常状态所必需的，一旦平衡打破即出现病理状态。MMP-9/TIMP-1比值升高，表明气道以炎症反应为主，将导致组织破坏；MMP-9/TIMP-1比值下降，则表明气道以修复为主，将导致组织纤维化。气道重塑是机体对呼吸道炎症损伤过程的一种修复反应，是气道反复炎症损伤与修复的结果。毕丽鑫[9]研究发现COPD大鼠BALF中MMP-9和TIMP-1表达水平在肺组织中随造模时间延长而逐渐增高，说明MMP-9和TIMP-1在COPD合并肺间质纤维化中起着重要作用，MMP-9/TIMP-1比值逐渐下降，说明TIMP-1增高在致纤维化作用中起重要作用。本研究结果表明，模型组MMP-9/TIMP-1比值明显低于正常组(P<0.05)，表明模型组存在MMP-9/TIMP-1平衡失调，且以TIMP-1表达水平升高更显著，其在抑制MMP-9活性的同时也引起了胶原的过度沉积，气道以修复为主可能出现气道壁向纤维化发展，最终导致气道重塑。值得注意的是经玉屏风散加味方治疗后大鼠MMP-9/TIMP-1比值与模型组比较差异不明显，提示当COPD出现气道重塑病变时，其病程可能已进入到不可逆的阶段。

TGF-β1为AM分泌的一种细胞因子。Crosby等[10]实验发现，当大鼠出现肺纤维化时，其TGF-β1含量增加，高于无支气管病变大鼠,表明通过拮抗TGF-β1可能会减轻气道重塑。TGF-β1是一种多效性的细胞因子，参与了COPD的多种病理过程。在COPD中被激活的AM释放TGF-β1可促使小气道平滑肌的增殖以及ECM合成，导致气道重塑。TGF-β1在细胞的生长、分化、免疫调节、炎症和损伤修复等方面发挥重要的作用[11]。本实验结果表明模型组大鼠TGF-β1表达水平升高，提示TGF-β1参与了COPD气道重塑。经玉屏风散加味方治疗后可下调TGF-β1表达水平，尤以高剂量组的下调最为明显，推测玉屏风散加味方可能通过涤痰逐瘀、活血化瘀等作用调节TGF-β1表达水平。

总之，TIMP-1是MMP-9的抑制剂，TIMP-1可以下调MMP-9酶原的激活，抑制已活化MMP-9酶活性来抑制MMP-9的生物学活性[12]。本实验结果表明当MMP-9表达升高时，TIMP-1和TGF-β1表达也随之升高，三者均参与了COPD气道重塑，且模型组MMP-9/TIMP-1比值明显低于正常组，表明当TIMP-1表达水平升高大于MMP-9升高时，气道发生纤维化。因此，在COPD防治策略中，应该充分考虑并兼顾三者之间的相互联系。另外，本实验对玉屏风散加味方不同浓度剂量的药效进行研究，发现高剂量下调MMP-9、TIMP-1、TGF-β1的作用尤为明显，可为临床治疗COPD提供一些思路。

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Study on the effect of Yupingfeng powder on the airway remodeling related cytokines in COPD patients

CHENG Yu, CHEN Jing, YANG Zhongshan, ZHANG Xiaomei, YUAN Jiali, CHEN Yu

(Yunnan College of Traditional Chinese Medicine, Kunming 650500, Yunnan, China)

Abstract:Objective It is to explore the regulating effect of Yupingfeng powder on MMP-9, TIMP-1 and TGF-β1 in COPD rats with airway remodeling. Methods 60 SD rats were randomly divided into normal group, model group, high, medium and low dose of Yupingfeng powder groups, positive group, each group had 10 rats. All the rats except in normal group were given passive smoking with LPS injected in airway to establish COPD model. The Yupingfeng powder groups were given Yupingfeng powder at the respective dose by gavage, the positive group was given erythromycin capsule solution by gavage, normal group and model group was given normal saline by gavage. After treating for 30 days, the levels of MMP-9, TIMP-1, TGF-β1 in bronchoalveolar lavage fluid of the rats were determined by ELISA, and MMP-9/TIMP-1 were calculated. Results The levels of MMP-9, TIMP-1, TGF-β1 in model group were significantly higher while MMP-9/TIMP-1 were lower than that in normal group (P<0.05), the levels in high and medium dose of Yupingfeng power groups and positive group were significantly lower than that in model group (P<0.05), the levels in high dose of Yupingfeng power group were lower than that in lower dose of Yupingfeng power group(P<0.05). Conclusion Yupingfeng powder can delay the development of airway remodeling induced by COPD, and the intervention mechanism may be achieved by regulating airway remodeling related cytokines MMP-9, TIMP-1, TGF-β1, and the effect is most significant in high dose group.

Key words:Yupingfeng powder; COPD; airway remodeling; MMP-9;TIMP-1; TGF-β1

[收稿日期]2015-03-15

[中图分类号]R-332

[文献标识码]A

[文章编号]1008-8849(2016)01-0007-04

doi:10.3969/j.issn.1008-8849.2016.01.003

[基金项目]云南省科技厅基础研究重点项目(2013FA041)；云南省应用基础研究项目(2015FB194)

[作者简介]程羽，男， 博士， 讲师， 研究方向为中西医结合基础。[通信作者]袁嘉丽， E-mail：YJL6688767@sina.com