MK571对脓毒症大鼠急性肺损伤的影响

苏　镔,夏文芳,周青山,郑颜磊

(武汉大学人民医院， 湖北 武汉 430060)



论著

MK571对脓毒症大鼠急性肺损伤的影响

苏镔,夏文芳,周青山,郑颜磊

(武汉大学人民医院， 湖北 武汉 430060)

[摘要]目的观察MK571对脓毒症大鼠急性肺损伤的影响。方法将45只雄性SD大鼠随机分为假手术组、脓毒症组和MK571干预组，每组15只。脓毒症组和MK571干预组采用盲肠结扎穿刺法制作脓毒症模型。MK571干预组术前30 min腹腔注射MK571 25 mg/kg。术后12 h和24 h采静脉血分别检测血清白细胞介素-1β(IL-1β)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)水平。术后24 h行支气管肺泡灌洗，留取灌洗液行白细胞计数，并留取肺组织做病理学观察评估肺组织损伤程度。结果脓毒症组大鼠术后血清IL-1β和TNF-α水平及支气管肺泡灌洗液中白细胞计数均显著高于假手术组(P均<0.05)，肺组织损伤明显。MK571干预组大鼠血清IL-1β和TNF-α水平及支气管肺泡灌洗液中白细胞计数均明显低于脓毒症组(P均<0.05)，肺组织损伤明显减轻。结论MK571可有效减轻脓毒症大鼠急性肺损伤。

[关键词]脓毒症；肺损伤；炎症；MK571；大鼠

脓毒症是感染引起的全身炎症反应综合征，是非心血管重症监护病房中病死率最高的疾病。肺脏是众多器官当中最常且最早受累的，随之而来的急性肺损伤和急性呼吸窘迫综合征会显著延长患者住院时间，增加病死率[1]。目前认为，炎症级联反应是脓毒症肺损伤的核心机制之一[2]。MK571是半胱氨酰白三烯受体1(CysLTR1)拮抗剂，具有抑制炎症反应的作用[3]。研究发现，MK571可减轻机械通气诱导的急性肺损伤[4]。本研究利用盲肠结扎穿刺法建立大鼠脓毒症动物模型，观察MK571对脓毒症大鼠急性肺损伤的影响。

1实验资料

1.1实验动物选用SPF级雄性SD大鼠，体质量230～280 g，由北京华阜康生物科技股份有限公司提供，动物合格证编号：11401300010595。实验前由武汉大学人民医院实验动物中心适应性饲养1周，温度20～26 ℃，相对湿度40%～60%，12 h/12 h光暗周期，自由饮水及进食。实验过程严格按照动物实验实施及管理办法执行。

1.2实验方法将45只SD雄性大鼠随机分为假手术组、脓毒症组和MK571干预组，每组15只。假手术组大鼠仅接受盲肠探查术，不结扎及穿刺。脓毒症组和MK571干预组均采用盲肠结扎穿刺法制作脓毒症模型：1%戊巴比妥钠(90 mg/kg)腹腔麻醉，剔除腹部局部毛发，消毒，沿腹正中线做2 cm切口，暴露盲肠，将粪便轻轻挤向盲肠盲端，丝线结扎盲肠2/3长度，用20G针头由系膜端向对侧穿通盲肠2次，于盲肠尖端穿刺1次，共5孔，避开血管，并挤出适量粪便，将盲肠放回腹腔，逐层缝合切口，术毕于皮下注射林格氏液3 mL/100 g，补充手术过程中体液的丢失及术后一段时间的需要量，以提高实验大鼠的生存率。MK571干预组大鼠行盲肠结扎穿刺术前30 min腹腔注射MK571 20 mg/kg。假手术组及脓毒症组术前30 min注射等容量生理盐水。

1.3检测项目

1.3.1细胞因子检测于术后12 h及24 h各抽取大鼠尾静脉血1 mL静置15 min，1 200 r/min、4 ℃离心20 min，采集血清，-20 ℃保存。用酶联免疫吸附(ELISA)法试剂盒检测术后12 h时白细胞介素-1β(IL-1β)水平和术后24 h时肿瘤坏死因子-α(TNF-α)(深圳欣博盛生物科技有限公司)水平，检测方法按照试剂盒说明书进行。

1.3.2支气管肺泡灌洗液中白细胞计数于术后24 h麻醉大鼠后开胸，气管切开后行左主支气管插管，套线结扎于主气管上防止灌洗液漏出及气管导管脱出，钳闭右主支气管并留取右下肺行病理检查。行左支气管肺泡灌洗，每次4 mL生理盐水共5次，回收率大于75%为合格，收集灌洗液，1 500 r/min、4 ℃离心10 min，离心后吸去上清液，沉淀所得细胞团用0.3 mL生理盐水悬浮，行白细胞计数，采用牛鲍氏板双人双盲计数，取平均值。

1.3.3肺组织病理学检查各组大鼠于术后24 h麻醉后取右肺下叶，多聚甲醛固定，常规石蜡切片(5 μm)，行苏木精-伊红(HE)染色，普通光镜下(×200)观察肺组织的充血、水肿、损伤及炎症细胞浸润情况。

1.4统计学方法采用SPSS19软件进行统计分析，计量资料以均数±标准差表示，采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t检验，P<0.05为差异具有统计学意义。

2结果

2.13组肺组织病理检查表现 假手术组大鼠肺组织结构较完整，肺间质无水肿，肺泡腔内无明显液体及细胞渗出，见图1。脓毒症组大鼠肺间质见大量炎性细胞浸润，肺泡结构破坏明显，肺泡隔增宽，肺泡腔可见广泛出血，毛细血管扩张，见图2。MK571干预组大鼠较脓毒症组大鼠肺组织炎症细胞浸润减少，肺泡隔增宽程度不及脓毒症组明显，出血明显减少，结构也较脓毒症组完整，见图3。

2.23组血清IL-1β、TNF-α含量比较脓毒症组大鼠术后12 h血清IL-1β水平和术后24 h血清TNF-α水平均显著高于假手术组(P均<0.05)，MK571干预组大鼠血清IL-1β和TNF-α水平均明显低于脓毒症组(P均<0.05)。见表1。

图1　假手术组大鼠肺组织病理切片HE染色表现(×200)

图2　脓毒症组大鼠肺组织病理切片HE染色表现(×200)

图3　MK571干预组大鼠肺组织病理切片HE染色表现(×200)

组别IL-1βTNF-α假手术组138.16±30.7721.58±3.82脓毒症组793.57±184.56①105.49±26.42①MK571干预组546.65±195.31①②77.69±22.59①②

注：①与假手术组比较，P<0.05；②与脓毒症组比较，P<0.05。

2.33组支气管肺泡灌洗液中白细胞计数比较假手术组、脓毒症组、MK571干预组支气管肺泡灌洗液中白细胞计数分别为(16.5±15.8)104L-1、(107.4±53.4)104L-1、(65.8±24.8)104L-1，脓毒症组白细胞计数显著高于假手术组(P<0.05)，而MK571干预组明显低于脓毒症组(P<0.05)。

3讨论

随着对脓毒症病理生理机制研究的不断深入，目前认为炎症反应在脓毒症所引起的多器官功能障碍综合征(MODS)的发生发展及转归中起最重要作用，是脓毒症多个发病机制的基础。在脓毒症中，大量炎症细胞激活及炎症因子释放造成组织器官损伤、血管扩张、血浆渗漏、氧供需障碍等，最终导致器官功能不全、MODS甚至多器官功能衰竭，引起患者死亡。本实验使用盲肠结扎及穿刺术模拟腹腔脏器穿孔引起的脓毒症，此方法能较好地模拟自然病程，是经典的脓毒症模型[5]。笔者在实验中观察到脓毒症模型大鼠较假手术组大鼠术后明显萎靡、活动减少、颤抖、呼吸频率加快，部分大鼠目内眦可见渗血；预实验病理检测提示明显肺部病变，模型制作可靠。

白三烯(LTs)是一组具有生物活性的由花生四烯酸(AA)经5-脂氧合酶(5-LO)代谢生成的一组脂类递质，包括白三烯A(LTA)、白三烯B (LTB)、白三烯C(LTC)、白三烯D(LTD)和白三烯E(LTE)。LTC、LTD和LTE统称为半胱氨酰白三烯(CysLTs)，CysLTs通过CysLTR1起作用，其在机体内含量不高但广泛参与变态反应及炎症反应，是一种强有力的炎症递质及趋化因子[6-7]。Petersen等[8]研究提示，内毒素小鼠支气管肺泡灌洗液中白三烯含量显著增加，其可通过CysLTR1依赖的机制引起低氧性肺血管收缩。DeClue等[9]研究证实，CysLTR1抑制剂扎鲁司特(Zafirlukast)可显著改善内毒素所致的低血压反应。Zhu等[10-11]研究发现，哮喘和慢性阻塞性肺疾病患者支气管黏膜中多种炎症细胞CysLTR1表达均显著增加，且与疾病严重程度相关。Yeh等[12]研究显示，肝脏缺血-再灌注损伤显著增加肺组织TNF-α含量和支气管肺泡灌洗液中白细胞计数，CysLTR1拮抗剂MK571处理可显著减少肺组织炎症浸润和组织损伤程度。这些研究提示，阻断CysLTR1介导的炎症反应可能是防治脓毒症组织损伤的新策略。

本研究病理检查结果发现，脓毒症组大鼠肺组织可见大量炎性细胞浸润，肺泡结构破坏明显，肺间质明显水肿增厚，而 MK571干预组肺组织炎症反应及肺泡结构损害程度显著减轻，说明脓毒症时炎症细胞在肺组织趋化并聚集，与细菌毒素和炎症因子一起对肺组织造成损伤，使肺组织结构破坏紊乱，肺泡闭合，并且使肺血管内皮屏障功能丧失，大量血浆成分及红细胞等渗出。而MK571干预则可减轻上述病理改变，提示MK571可能通过拮抗CysLTR1的作用从而减轻内毒素及炎症因子在肺组织的促炎症作用，并有一定的血管内皮屏障稳定作用。本研究中脓毒症组大鼠支气管肺泡灌洗液中白细胞计数明显升高，提示脓毒症过程中，远离感染部位的肺脏受到血流中细菌毒素、炎症细胞及炎症因子的影响出现白细胞迁移浸润；MK571干预组支气管肺泡灌洗液中白细胞计数显著减少，证明MK571干预对炎症细胞的浸润迁移有一定的抑制作用。

血浆中炎症因子增加是脓毒症的典型特征之一，IL-1β、TNF-α及IL-6是主要的促炎症细胞因子，其在炎症时升高的多少可以反映炎症反应的严重程度。本实验中脓毒症组术后12 h时血清IL-1β含量和术后24 h时血清TNF-α含量均显著高于假手术组，MK571干预组二者含量均明显降低，提示MK571不仅可减轻肺组织局部炎症反应，还可能通过减轻感染原发灶的炎症反应来减轻全身的炎症反应程度，而事实上炎症组织中的炎症因子浓度要远远高于血浆中的水平，这也提示MK571在脓毒症的炎症过程中可能对其他器官及组织也具有一定的抗炎保护作用，如肾脏、肝脏、脑组织，但这有待进一步实验证实。

综上所述，脓毒症大鼠肺组织呈现明显炎症状态，血清炎症因子水平升高，肺组织损伤明显，MK571干预可显著降低血清炎症因子水平，可抑制炎症细胞的浸润迁移，对脓毒症诱导的急性肺损伤有明显保护作用。

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Effect of MK571 on sepsis-induced acute lung injury in rats

SU Bin, XIA Wenfang, ZHOU Qingshan, ZHENG Yanlei

(Renmin Hospital of Wuhan University, Wuhan 430060, Hubei,China)

Abstract:Objective It is to explore the effect of MK571 on sepsis-induced acute lung injury in rats. Methods Forty-five SD rats were randomly divided into three groups: sham-operated group, sepsis group, and sepsis plus MRP4 inhibitor treatment group(intervention group), with 15 rats in each group. Sepsis was induced by cecal ligation and puncture in sepsis group and intervention group. MK571 (25 mg/kg) was administrated by intraperitoneal injection 30 minutes before induction of sepsis in intervention group. Serum interlukin-1β (IL-1β) and tumor necrosis factor alpha (TNF-α) levels were measured by enzyme-linked immunosorbent assay at 12 hours and 24 hours after surgery respectively. At 24 hours after surgery, the lungs were collected for histopathological examination, and bronchoalveolar lavage fluid was harvested for white blood cell-counting. Results Compared with sham group, serum IL-6 and TNF-α levels were significantly higher in sepsis group. White blood cell count in bronchoalveolar lavage fluid was elevated and lung injury was increased in sepsis group compared to sham group. Importantly, MK571 treatment significantly decreased serum IL-6 and TNF-α levels, reduced white blood cell count in bronchoalveolar lavage fluid, and improved lung injury. Conclusion MK571 can effectively relieve acute lung injury in septic rats.

Key words:sepsis; lung injury; inflammation; MK571; rat

[收稿日期]2015-05-14

[中图分类号]R-332

[文献标识码]A

[文章编号]1008-8849(2016)01-0001-03

doi:10.3969/j.issn.1008-8849.2016.01.001

[基金项目]国家自然科学基金资助项目(81301620)

[作者简介]苏镔，男，硕士研究生在读，主要从事脓毒症时肺保护的研究。[通信作者]周青山，E-mail: zhtoo163@hotmail.com；夏文芳，E-mail: xiawenfang2004@sina.com