长清茶抗氧化活性研究

黄翊鹏 张荣亭 张利云 姜慧玲 张珊

摘要：在测定多酚的基础上，利用5种体外抗氧化模型（脂质过氧化抑制作用、DPPH自由基清除作用、羟基自由基清除作用、Fe²⁺络合能力及Fe³⁺还原力）对长清灵岩茶与南方茶抗氧化活性进行了比较研究。结果表明：茶汤中多酚含量为长清绿茶[（0.3106±0.0054）m∥mL]>南方绿茶[（0.2888±0.0039）mg/mL]、长清红茶[（0.1691±0.0029）mg/mL]>南方红茶[（0.1560±0.0015）mg/mL]。长清茶的脂质过氧化抑制作用、DPPH自由基清除作用、Fe²⁺络合能力及Fe³⁺的还原力均好于南方茶，且高于对照BHT、没食子酸；长清茶的羟基自由基清除作用好于南方茶与没食子酸，但低于BHT。因此，长清茶具有良好的抗氧化活性。

关键词：长清绿茶；长清红茶；抗氧化活性；多酚

中图分类号：S571.109.9

文献标识号：A 文章编号：1001-4942（2016）02-0053-05

济南市长清区作为中国高纬度茶叶适生区，从20世纪50年代开始进行“南茶北引”实验，恢复茶树栽培种植以来，经过不断的生产品种改良和技术改进，茶叶面积、产量、产值持续增长，已逐步形成了集种植、采集、加工到定点销售为一体，绿茶、红茶、乌龙茶等多种茶叶多样发展的特色产业格局。长清茶叶因其具有独特的“香气高、滋味浓、耐冲泡”等南方高山茶才有的品质，日益受到消费者的青睐，并呈现出良好的发展态势。

目前，关于南方茶有效成分及抗氧化作用方面的研究很多，但关于长清茶抗氧化作用方面的研究尚未见报道，尤其是关于长清茶与南方茶抗氧化作用的对比，一直缺乏理论依据。因此，本研究以长清茶和南方茶为样品，在测定多酚含量的基础上，以没食子酸、BHT为对照，选取5种体外模型：脂质过氧化抑制作用、DPPH自由基清除作用、羟基自由基清除作用、Fe²⁺络合能力、Fe³⁺还原能力，比较了长清茶与南方茶的抗氧化作用，以期为长清茶的品牌宣传提供理论支持，为长清茶的综合利用提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

长清绿茶、长清红茶、南方绿茶、南方红茶，均由山东立泰山茶业科技开发有限公司提供。

1.2 试剂与仪器

无水乙醇，95%乙醇，甲醇，30%双氧水，铁氰化钾，三氯化铁，六水三氯乙酸，无水碳酸钠，福林酚试剂，卵磷脂，2-硫代巴比妥酸，BHT，没食子酸，磷酸二氢钠，磷酸氢二钠，浓盐酸，硫酸亚铁，DPPH，水杨酸，Ferrozine铁试剂等，均为分析纯。

HI2221型pH计（哈纳仪器）；UV-9000型紫外/可见分光光度计（上海元析仪器有限公司）；离心机（美国贝克曼库尔特商贸有限公司）；Auv120分析天平（SHIMADAZU公司）；HWS-2电热恒温水浴锅（上海齐欣科学仪器有限公司）。

1.3 试验方法

1.3.1 样品的处理 准确称取5g样品于150mL沸水中浸泡5min，立即用纱布过滤，冷却后用滤纸过滤，将滤液稀释10倍后备用。

1.3.2 多酚含量的测定取0.1mL待测液加入2%的Na²CO³2.0mL，静置2min，加入50%福林酚试剂0.1mL，静置30min，在720nm处测吸光度。以没食子酸标准品配制标准液，按上述方法绘制没食子酸标准曲线，用没食子酸当量表示多酚含量。

1.3.3 脂质过氧化抑制作用的测定硫酸亚铁-Vc溶液的配制：分别取347.5mgFeSO⁴和35mgVc，用蒸馏水定容至25mL。显色剂的配制：取15g三氯乙酸、0.375g硫代巴比妥酸、

2.1 mL浓HCl，用蒸馏水定容至100mL。

以PBS缓冲液（10mmol/L，pH7.4）为溶剂配制10mg/mL的卵磷脂溶液。在试管中加入2mL待测液，再依次加入0.1mL卵磷脂溶液、50μL硫酸亚铁-Vc溶液，用PBS缓冲液（10mmol/L，pH7.4）定容至3mL。37℃水浴40min，加入2mL显色剂，沸水浴15min，5000r/min离心10min，在532nm处测吸光度。用BHT、没食子酸作对照。

脂质过氧化抑制率（%）=

1.3.4 DPPH自由基（DPPH·）清除作用的测定将0.1mL待测液加入1.4mLO.1mmol/LDPPH乙醇溶液中，95%乙醇定容至3mL，避光静置30min。在517nm处测吸光度，模型管用乙醇代替样品，用BHT、没食子酸作对照。

DPPH·清除率（%）=

1.3.5 羟基自由基（·0H）清除作用的测定取0.088mol/LH₂O₂溶液0.25mL于试管中，加入9.Ommol/L FeSO₄溶液0.25mL，9.1mmol/L水杨酸一乙醇溶液0.25mL，用待测液定容至5mL，摇匀，静置反应3min，在510nm处测吸光度。用BHT、没食子酸作对照。

·OH清除率（%）=

1.3.6 Fe²⁺络合能力的测定取50μL待测液，加入1mmol/L FeSO₄溶液25μL，5mmol/LFerrozlne铁试剂溶液50μL，静置10min，用甲醇溶液补足至3mL，在562nm处记录吸光度。模型管用甲醇代替待测液，用BHT、没食子酸作对照。

Fe²⁺络合率（%）=

1.3.7 Fe³⁺还原能力的测定取200μL待测液，加入PBS缓冲液（0.2mmol/L，pH6.6）1mL，1%铁氰化钾溶液1mL，50℃水浴20min，加入10%三氯乙酸1mL，4000r/min离心10min，取上清液2mL，加入蒸馏水2mL、0.1%三氯化铁400μL，混匀，在700 nm处记录吸光度。用BHT、没食子酸作对照。

1.4 数据处理

数据采用Microsoft Excel和SPSS软件进行统计和分析，数据用平均值±SD表示，平均数之间的多重比较采用Duncan's新复极差检验方法。

2 结果与分析

2.1 多酚含量的测定

没食子酸标准曲线如图l所示，当没食子酸浓度在0.01-0.04mg/mL之间时，反应显色灵敏、稳定，具有良好的线性关系。标准方程为：y=0.0559x+0.0004，R?=0.9969，式中y表示没食子酸浓度，x表示吸光度。

以没食子酸当量表示多酚含量，根据标准曲线计算得出，长清绿茶、南方绿茶、长清红茶、南方红茶茶汤稀释后多酚含量分别为：（0.0310±0.0005）、（0.0288±0.0004）、（0.0169±0.0003）、（0.0156±0.0002）mg/mL，表明无论绿茶、红茶，长清茶茶汤多酚含量高于南方茶。

2.2 脂质过氧化抑制作用的测定

在测定两种茶样茶汤多酚含量的基础上，以没食子酸和BHT作为对照，进一步测定了其抗氧化活性。由图2、图3可知，长清绿茶的脂质过氧化抑制率最高，可达95.48%，南方绿茶次之，为95.41%，BHT为81.07%，没食子酸最低，为64.32%；长清红茶的脂质过氧化抑制率为96.34%，南方红茶为96.20%，BHT为74.23%，没食子酸最低，为52.47%。长清茶的脂质过氧化抑制作用要略高于南方茶，两者间无显著差异（P<0.05），但均显著高于对照。

2.3 DPPH自由基（DPPH·）清除作用的测定

由图4、图5可知，无论是绿茶还是红茶，长清茶的DPPH自由基清除率均显著高于南方茶与两种对照。对DPPH自由基清除率大小顺序依次为：长清绿茶（89.12%）>南方绿茶（86.28%）>没食子酸（68.03%）>BHT（6.69%）；长清红茶（78.23%）>南方红茶（70.98%）>没食子酸（39.57%）>BHT（6.46%）。

2.4 羟基自由基（·OH）清除作用的测定

羟基自由基是对人体毒性最大的自由基，常作为判断待测物是否具有抗氧化性的指标。由图6、图7可知，BHT对羟基自由基的清除能力最强，没食子酸最弱，不论是绿茶还是红茶，长清茶要显著高于南方茶。绿茶对羟基自由基的清除率由大到小的顺序为：BHT（67.63%）>长清绿茶（8.30%）>南方绿茶（5.68%）>没食子酸（0.68%）；红茶对羟基自由基清除率大小的顺序为：BHT（69.15%）>长清红茶（24.80%）>南方红茶（10.40%）>没食子酸（0.89%）。

2.5 Fe²⁺络合能力的测定

Fe²⁺能够催化Fenton反应导致羟基自由基的生成，多酚类物质能与Fe²⁺络合，减少羟基自由基的生成，间接抑制脱氧核糖降解。由图8、图9可知，长清绿茶的Fe²⁺络合率最高，为14.32%，显著高于南方绿茶（9.14%）、BHT（7.34%）、没食子酸（3.54%），南方绿茶和BHT的Fe2+络合能力无显著差异（P<0.05）；长清红茶的Fe²⁺络合率为9.78%，显著高于BHT（6.29%）、南方红茶（3.96%）、没食子酸（1.00%）。可见，无论是绿茶还是红茶，长清茶均显示出较好的Fe²⁺络合能力，而南方茶与BHT的Fe²⁺络合能力没有显著差异。

2.6 Fe³⁺还原能力的测定

还原能力是表征物质在氧化还原反应中给出电子、自身发生氧化的能力，既是物质抗氧化活性的重要表现，又是对其抗氧化能力的合理解释。实验研究中通常采用三价铁离子还原法观察物质的还原能力，以吸光度表示结果，吸光度值越大，说明样品的还原能力越强。由图10、图II可看出，长清绿茶的Fe³⁺还原力（1.16）显著高于南方绿茶（1.12）与BHT（O.10）和没食子酸（0.13），长清红茶（0.46）的Fe3+还原力显著高于南方红茶（0.45）与BHT（O.09）和没食子酸（0.03）。

3 讨论与结论

越来越多的研究表明，茶的许多抗氧化活性指标都与茶多酚含量有明显的正相关性。陈金娥、陈雪等的研究表明，DPPH自由基清除作用与茶多酚和儿茶素含量呈正相关；赵国玲等对不同种类海藻多酚含量和还原力的对比研究发现，三类海藻的多酚含量和还原力之间显著正相关；孙怡对冬青苦丁茶及大叶冬青苦丁茶的研究也表明，羟基自由基清除率、DPPH自由基清除率、Fe³⁺还原力均呈正相关性；曹炜等的研究表明，不同种蜂蜜的总酚酸含量越高，其脂质过氧化抑制作用越高；何秋彤研究表明，不同木锦花提取物的抗氧化性都在不同程度上与总酚含量呈正相关，但对20种凉茶的研究表明，茶多酚含量与脂质过氧化抑制能力没有明显的相关性，凉茶试样的总酚含量与其抗氧化能力之间的相关性不显著。长清绿茶、红茶茶多酚的体外抗氧化试验表明，抗氧化活性与多酚含量有明显的正相关性。长清绿茶、红茶具有一定的脂质过氧化抑制作用、DPPH和羟基自由基的清除能力、Fe²⁺络合能力以及Fe³⁺还原力，对于不同的体系清除效果有所不同。

据报道，苦丁茶粗提物的浓度为0.3589mg/mL时，DPPH，清除率为50%。郑海燕研究表明，茶多酚浓度为0.8mg/mL时，紫阳绿茶和西乡绿茶多酚的羟基自由基清除率分别为60%和54%。杏花花粉的醇提物对卵磷脂氧化抑制作用的IC50，为（4.0353±0.2525）mg/mL。桑叶70%醇提物对Fe²⁺络合能力的IC50为20.89mg/mL。而本试验用沸水浸提得到的长清绿茶茶汤[（0.0310±0.0005）mg/mL]的DPPH自由基清除率为89.12%，羟基自由基的清除率为8.30%，脂质过氧化抑制率为95.48%，Fe²⁺络合能力为14.32%；长清红茶茶汤[（0.0169±0.0003）mg/mL]的DPPH自由基清除率为78.23%，羟基自由基的清除率为24.80%，脂质过氧化抑制率为96.34%，Fe²⁺络合能力为9.78%。表明长清茶具有较好的抗氧化能力，明显优于南方茶，这可能是由于长清茶较南方茶种植纬度高、昼夜温差大、叶片厚、茶叶中多酚类物质含量较南方茶多的缘故。本研究从体外抗氧化活性这一角度对比了长清绿茶、红茶与南方绿茶、红茶，为进一步开发利用长清茶提供了理论支持和科学数据。