韭菜迟眼蕈蚊抗药性与4种酶活性关系研究

齐素敏 张宗营 张程程 庄乾营 张思聪 周仙红 于毅 刘永杰

摘要：为了解山东省不同地区韭菜迟眼蕈蚊种群抗药性与乙酰胆碱酯酶（AChE）、谷胱甘肽S-转移酶（GSTs）、羧酸酯酶（CarE）和细胞色素P450氧脱甲基酶（ODM）的活性关系，采用分光光度计法测定不同地区韭菜迟眼蕈蚊种群AChE、GJSTs、CarE和ODM的活性。结果表明：泰安市、莘县、寿光市、临沭县4个地区韭菜迟眼蕈蚊种群的AChE、GSTs和ODM活性较相对敏感品系均有不同程度升高，相对比值分别为1.43-2.42、1.24-3.07和1.28-2.61，且与相对敏感品系相比差异显著（P<0.05），CarE相对比值为1.02-1.20，多数种群与相对敏感品系无显著性差异。说明AChE、CJSTs和ODM与韭菜迟眼蕈蚊抗药性的产生和发展密切相关，其活性相对比值可作为韭菜迟眼蕈蚊抗药性的监测指标。

关键词：韭菜迟眼蕈蚊；抗药性；酶活性

中图分类号：S436.33

文献标识号：A 文章编号：1001-4942（2016）02-0094-05

韭菜迟眼蕈蚊（BradVsia odoriphaga Yang etZhang），属双翅目眼蕈蚊科迟眼蕈蚊属，是我国北方重要的蔬菜害虫。韭菜迟眼蕈蚊生活周期短、繁殖力强，寄主范围广，可为害百合科、菊科、藜科、十字花科、葫芦科、伞形花科等7科30多种蔬菜，在江西、北京等地还为害食用菌。该虫以幼虫群集寄主根部蛀食，常造成韭菜缺苗断垄，使韭菜减产甚至绝产，近年来发生有加重趋势。目前，化学防治仍是控制韭菜迟眼蕈蚊的主要措施，随着化学杀虫剂的长期和大量使用，韭菜迟眼蕈蚊对常用杀虫剂产生了不同程度的抗药性。抗性增强使农药使用效率降低，加大了防治难度。了解韭菜迟眼蕈蚊的抗药性状况，明确抗性种群的生化机制，可有针对性地采取防治措施，提高防治效果。乙酰胆碱酯酶（AChE）、谷胱甘肽S-转移酶（GSTs）、羧酸酯酶（CarE）和细胞色素P450氧脱甲基酶（ODM）是韭菜迟眼蕈蚊体内重要的靶标酶和解毒酶，与昆虫抗药性的产生存在一定关系。目前，有关韭菜迟眼蕈蚊抗药性与AChE、GSTs、CarE和ODM活性关系的研究未见报道。本研究通过对山东省不同地区韭菜迟眼蕈蚊抗药性与4种酶活性关系的研究，进一步明确AChE、GSTs、CarE和ODM与抗药性产生的相关性，探讨其生化特征作为韭菜迟眼蕈蚊抗药性监测指标的可行性，为有效治理该虫提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 供试昆虫

相对敏感种群：实验室内连续饲养多代的韭蛆，期间未接触任何药剂，作为本试验相对敏感种群；

泰安种群：采自山东省泰安市邱家店镇旧县村小拱棚三年生韭菜地；

莘县种群：采自山东省聊城市莘县张寨乡郭坊村小拱棚四年生韭菜地；

寿光种群：采自山东省寿光市化龙镇埠西村小拱棚四年生韭菜地；

临沭种群：采自山东省临沂市临沭县曹庄镇新华村小拱棚两年生韭菜地。

每个地区种群均于2015年5月采集，室内饲养一代，选取F1代供试。相对敏感种群和田间种群均选取个体大小较一致的健康3龄幼虫做为供试虫源。

1.2 供试药剂

考马斯亮蓝蛋白测定试剂盒、GSTs测试盒、AChE测试盒、CarE测试盒，均由南京建成生物工程研究所生产。磷酸氢二钠（Na₂HPO₄·12H₂O），天津市凯通化学试剂有限公司。磷酸二氢钠（NaH₂PO₄·2H₂O），天津市凯通化学试剂有限公司。氢氧化钠（NaOH），天津市凯通化学试剂有限公司。三氯甲烷（trichloromethane），天津市凯通化学试剂有限公司。对硝基苯酚（p-ni-trophenol），西亚试剂。还原型辅酶Ⅱ（NADPH），上海伯奥生物科技有限公司。对硝基苯甲醚（4-nitroanisole），分析纯，Sigma公司。

1.3 试验方法

1.3.1 酶源制备 ①乙酰胆碱酯酶（AChE）、谷胱甘肽S-转移酶（GSTs）酶源制备。挑取韭菜迟眼蕈蚊3龄幼虫，准确称重，按重量体积1∶9的比例加入生理盐水，在碎冰中用玻璃匀浆器匀浆，2500r/min、4℃离心10min，取上清液作为酶源。

②羧酸酯酶（CarE）酶源制备。挑取韭菜迟眼蕈蚊3龄幼虫，准确称重，按重量体积1∶（5～10）的比例进行冰浴匀浆，15000r/min，4℃离心30min，取上清液作为酶源。

③细胞色素P450氧脱甲基酶（ODM）酶源制备。挑取韭菜迟眼蕈蚊3龄幼虫，准确称重，按重量体积1∶9的比例加入0.05mol/L pH 7.8磷酸缓冲液，余同①。

1.3.2 蛋白质含量测定 采用考马斯亮蓝试剂盒进行测定。用标准蛋白（0.563g/L）作为标准。

1.3.3 乙酰胆碱酯酶（AChE）活性测定 采用AChE试剂盒进行测定，方法步骤按照试剂盒说明书进行，重复3次。组织中AChE活力定义：每毫克组织蛋白在37℃保温6min，水解反应体系中1μmol基质为1个活力单位。计算公式：

AChE活力（U/mg prot）=（测定OD值-对照OD值）÷（标准OD值-空白OD值）×标准管浓度（1μmol/mL）÷样本蛋白质含量（mg prot/mL）

1.3.4 谷胱甘肽S-转移酶（GSTs）活力测定采用GSTs试剂盒进行测定，方法步骤按照试剂盒说明书进行，重复3次。组织中GSTs活力单位定义：每毫克组织蛋白在37℃反应l min扣除非酶促反应，使反应体系中GST浓度降低1μmol/L为一个酶活力单位。计算公式：

GSTs活力（U/mg prot）=（对照OD值-测定OD值）÷（标准OD值-空白OD值）×标准管浓度（20μmol/L）×稀释倍数（6倍）÷反应时间（10min）÷样本取样量（0.1mL）×匀浆液蛋白浓度（mg prot/mL）]

1.3.5 羧酸酯酶（CarE）活性测定 采用CarE试剂盒进行测定，方法步骤按照试剂盒说明书进行，重复3次。按样本质量计算，组织匀浆中CarE的活力定义：每克组织在37℃每分钟催化吸光值增加1，定义为1U。计算公式：

CarE活力（U/g）=67×（△A测定管-△A空白管）÷样本质量（g）

1.3.6 细胞色素P450氧脱甲基酶（ODM）比活力测定参考Hansen等的方法。称取一定量对硝基苯酚，将对硝基苯酚溶解在NaOH溶液中，配成梯度浓度对硝基苯酚的NaOH溶液，在400nm下比色，做出标准曲线。X轴为对硝基苯酚的量，Y轴为OD值。反应总体系2mL：O.1mol/LpH7.8的磷酸缓冲液1270μL，0.36 mmol/LNADPH 200μL，3mmol/L对硝基苯甲醚30μL，酶液500μL。反应体系在25℃振荡温育反应30min，加入0.5mL lmol/L HCl终止反应，再加入2.5mL三氯甲烷萃取反应产物对硝基苯酚，在3000r/min下离心15min。取下层即三氯甲烷层1.5mL加入1.5mL O.5mol/L NaOH反萃取。NaOH萃取液在400nm比色分析，重复3次，得到OD值，以0.5mol/L NaOH溶液为对照。然后根据对硝基苯酚标准曲线和每毫升酶液中所含蛋白的量求出每分钟每毫克蛋白产生的对硝基苯酚摩尔数来表示酶活性[μmol/（min·mg）]。

1.4 数据分析

试验数据使用SPSS 19.O数据处理软件和Microsoft Excel 2010表格软件分析、处理。

2 结果与分析

2.1 AChE活性

不同地区种群韭菜迟眼蕈蚊乙酰胆碱酯酶（AChE）活性比较结果（表1）显示，4个不同地区韭菜迟眼蕈蚊种群AChE活性较相对敏感品系均有不同程度提高，与相对敏感种群的活性比值由高到低分别是莘县、泰安、寿光和临沭种群，分别为2.42、2.27、2.11和1.43倍。4个韭菜迟眼蕈蚊田间种群AChE活性与相对敏感品系AChE活性差异显著。

2.2 GSTs活性

不同地区韭菜迟眼蕈蚊种群谷胱甘肽S-转移酶（GSTs）活性比较结果（表1）显示，4个韭菜迟眼蕈蚊种群GSTs活性较相对敏感品系均有不同程度提高，莘县种群的GST活性最高，是相对敏感品系的3.07倍；泰安和寿光种群的GST活性次之，分别为相对敏感品系的2.39和1.82倍；而临沭种群相对比值是相对敏感品系的1.24倍，活性最低。4个韭菜迟眼蕈蚊田间种群与相对敏感品系GSTs活性均有显著性差异。

2.3 CarE活性

不同地区韭菜迟眼蕈蚊种群羧酸酯酶（CarE）活性比较结果（表1）显示，4个韭菜迟眼蕈蚊田间种群CarE活性较敏感品系略有升高，泰安种群的CarE活性最高，是相对敏感品系的1.20倍，其它3个韭菜迟眼蕈蚊品系酶活性与相对敏感品系酶活性比值在1.02和1.06之间。4个韭菜迟眼蕈蚊田间种群CarE活性变化幅度较小，仅泰安种群CarE活性与相对敏感品系有显著性差异。

2.4 0DM活性

不同地区韭菜迟眼蕈蚊种群细胞色素P450氧脱甲基酶（ODM）活性比较结果（表1）显示，4个韭菜迟眼蕈蚊种群ODM活性较相对敏感品系均有不同程度提高，莘县种群的ODM活性最高，是相对敏感品系的2.61倍，寿光和泰安种群的ODM活性次之，分别为相对敏感品系的1.50和1.47倍，这3个韭菜迟眼蕈蚊田间种群与相对敏感品系ODM活性有显著性差异；而临沭种群ODM活性相对比值是相对敏感品系ODM活性的1.28倍，两者无显著性差异。

3 结论与讨论

笔者已研究了泰安市、莘县、寿光市、临沭县韭菜迟眼蕈蚊种群对6种杀虫剂的抗药性水平（另文），结果显示4个不同地区韭菜迟眼蕈蚊种群对毒死蜱、辛硫磷、高效氯氰菊酯和高效氯氟氰菊酯等常用药剂均产生了不同程度的抗药性。对有机磷类药剂毒死蜱和辛硫磷，泰安、莘县和寿光种群均产生了中等水平的抗性，莘县种群抗性分别为30.47和24.05倍，泰安种群的抗性为19.67和25.69倍，寿光种群的抗性为15.97和17.80倍；莘县种群对菊酯类药剂高效氯氰菊酯也产生了中等水平的抗性，抗性为11.45倍。4个不同地区韭菜迟眼蕈蚊种群中，临沭种群抗性最低，对毒死蜱和辛硫磷产生了低等抗药性，对两种菊酯类药剂还处于敏感状态。

乙酰胆碱酯酶（AChE）是有机磷和氨基甲酸酯类杀虫剂的作用靶标，靶标敏感性降低是昆虫抗药性产生涉及的主要机制之一。谷胱甘肽S-转移酶（GSTs）、羧酸酯酶（CarE）和细胞色素P450氧脱甲基酶（ODM）是昆虫体内重要的解毒酶，研究表明，害虫抗药性的增强与杀虫剂代谢相关的解毒酶活性的增强有关，而不同的解毒酶对不同杀虫剂的抗性发展作用不同。研究结果显示，4个不同地区韭菜迟眼蕈蚊种群AChE活性较敏感品系均有显著性差异，说明AChE作为靶标酶参与了韭菜迟眼蕈蚊抗药性的形成。莘县种群对毒死蜱的抗性水平最高，其AChE的活性比值也最高，说明韭菜迟眼蕈蚊对常用药剂的抗性与AChE活性具有正相关性。由此推断，抗性韭菜迟眼蕈蚊AChE过高的表达量可能导致了其AChE敏感性的降低。具有抗性的田间种群GSTs和ODM活性较敏感品系有明显升高，说明解毒酶GSTs、ODM活性增高是导致抗性产生的原因之一，抗性监测和酶活试验结果比较发现，抗性水平最高的莘县韭菜迟眼蕈蚊种群，其GSTs、ODM活性也较高，泰安、寿光种群抗性水平较低，其GSTs、ODM活性较前者略低，抗药性和酶活性具有一定的正相关性，进一步证明了GSTs及ODM作为韭菜迟眼蕈蚊体内解毒酶，其活性高低与韭菜迟眼蕈蚊的抗药性水平密切相关。据报道，CarE活性的改变，是多种昆虫产生抗药性的重要生化因素之一，但本研究发现，田间韭菜迟眼蕈蚊种群CarE活性与相对敏感品系相比略有升高，4个种群中有3个种群CarE活性同相对敏感品系差异不显著，说明韭菜迟眼蕈蚊CarE活性的变化与抗药性水平无明显相关性。

韭菜迟眼蕈蚊田间种群与相对敏感种群AChE、GSTs和ODM活性上的差异表明AChE、GSTs和ODM与韭菜迟眼蕈蚊抗药性的产生密切相关，AChE、GSTs和ODM活性相对比值可作为韭菜迟眼蕈蚊对常用药剂抗性的监测指标。CarE与抗药性的关系不密切，其活性相对比值仅能作为韭菜迟眼蕈蚊抗药性的参考指标。然而，对抗性韭菜迟眼蕈蚊酶活性测定的工作尚不全面，磷酸酯酶、超氧化物歧化酶等与昆虫抗药性有关的酶活性测定都未进行，这些酶活性与韭菜迟眼蕈蚊抗药性的关系有待于进一步研究和探讨。