木质素降解酶系在毕赤酵母中的表达及降解木质素的活性

刘金雷　刘天佳　于莹等

摘要：自然界中的木质素是潜在的丰富的可再生资源，近年来利用生物法降解木质素成为研究的热点。利用RT-PCR克隆了黄孢原毛平革菌（Phanerochaete chrysosporium）木质素过氧化物酶基因（LiP）、锰过氧化物酶基因（MnP）、黑曲霉（Asperillus niger）葡萄糖氧化酶基因（gox）及白腐真菌（White Rot Fungi）漆酶基因（Lac），并构建了毕赤酵母（Pichia pastoris）表达载体，电转化入Pichia pastoris X-33宿主菌中，获得转化子并进行微培养，通过测定培养液的酶活，筛选出高酶活菌株。对4种重组菌株进行发酵，以经过处理的玉米皮作为底物，分别加入4种酶的发酵液及4种酶的混合液，于30 ℃反应后测定不同反应时间木质素的降解量，反应24h，木质素过氧化物酶、锰过氧化物酶、葡萄糖氧化物酶、漆酶吸光度D280nm的降低幅度分别为45%、39%、9%、57%；复合酶降解木质素的活性明显高于单一酶，吸光度的降低幅度为78%，说明木质素降解酶系的相互协同作用，提高了木质素的降解效率，为木质素酶解提供了新方法。

关键词：木质素；降解酶系；新方法；异源表达；毕赤酵母；酶活性

中图分类号： S188+.3文献标志码： A文章编号：1002-1302（2015）11-0058-05

收稿日期：2014-11-16

作者简介：刘金雷（1988—），男，河北邯郸人，硕士研究生，研究方向为分子定向进化与生物催化。E-mail：1060083086@qq.com。

通信作者：李天明，硕士，助理研究员，研究方向为分子定向进化与生物催化。E-mail：iamltm2000@hotmail.com。木质素是一种丰富的天然可再生的有机高分子化合物，广泛存在于植物体中，它包围着纤维素，和半纤维素一起填充于微原纤维之间，与纤维素、半纤维素一起构成植物细胞壁的主要成分，是自然界中植物光合作用制造的总量仅次于纤维素的碳素资源[1]。据估计，全世界每年由植物生长产生的木质素达1 500亿t，其中造纸工业废液中产生的工业木质素有3 000万t[2]，因此对大自然给予人类的木质素等丰富的可再生天然资源予以充分重视并加以研究和利用，对于可持续发展具有重要意义。

木质素的结构复杂，不易分解[3-4]，从20世纪开始，国内外的学者一直寻找木质素降解的最佳途径，研究内容主要包括物理法、化学法、物理化学法、生物降解法[5]。木质素的微生物降解不仅可以缓解环境污染、变废为宝，而且对生物质资源的充分利用有重大的现实意义，因此对木质素的生物降解已经成为当今世界国内外学者的研究热点[6-9]。木质素的降解是由一系列酶协同完成的，目前已知，在降解木质素过程中起主导作用的主要是漆酶（laccase，LAC）、木质素过氧化物酶（lignin peroxidase，LIP）、锰过氧化物酶（manganese peroxidase，MNP）这3种酶[10]。此外，葡萄糖氧化酶（glucose 1-oxidase，GO）、芳醇氧化酶（aryl-alcohol oxidase，AAO）、乙二醛氧化酶（gyoxaloxidase，GLOX）等也对木质素的降解产生一定的影响或者直接参与其降解[11]。

木质素降解的相关酶最早是在白腐真菌的胞外培养液中发现的，近年来随着国内外学者对木质素降解酶系的研究进展，发现在自然界中木质素的降解是由真菌、细菌、放线菌三者共同作用的结果，其中真菌起主要作用[12]。自然界中降解木质素能力最强的一类真菌是白腐菌[13-16]，白腐菌虽然有广谱的酶系统，但是由于其生理代谢的特殊性以及近乎苛刻的对环境因子的要求，对于实现工业化产酶产生了严重阻碍。随着分子生物学的发展，基因工程菌的构建和木质素酶系的异源表达成为从根本上解决这一问题的一种可能的途径。本研究主要利用基因重组技术，利用毕赤酵母（Pichia pastoris）分泌表达了不同来源的木质素过氧化物酶、锰过氧化物酶、葡萄糖氧化酶、漆酶基因，利用工程菌的发酵液降解天然木质素，并通过木质素降解酶系的协同作用，增强了木质素的降解效率，为木质素酶解提供了新方法。

1材料与方法

1.1试验材料

1.1.1菌种和质粒大肠杆菌Trans 5α菌株购自北京全式金生物技术有限公司，P. pastoris X-33菌株和表达质粒pGAPZαA由河北科技大学分子生物学实验室保存，黄孢原毛平革菌（Phanerochaete chrysosporium）、黑曲霉（Asperillus niger）、白腐真菌（White Rot Fungi）为笔者所在实验室保藏的野生型菌株。

1.1.2培养基LB、YPDS、YPD培养基均按照《Invitrogen公司操作手册》推荐的方法配制。

1.1.3试剂限制性内切酶、T4 DNA连接酶、Taq DNA聚合酶、BcabestTM RNA PCR试剂盒，购自宝生物工程（大连）有限公司（TaRaKa）；Trizol Reagent，购自Gibco公司；DNA回收试剂盒、质粒提取试剂盒、琼脂糖，购自天根生化科技（北京）有限公司；PMD-18克隆载体，购自北京全式金生物技术有限公司；PCR引物由上海英骏生物技术有限公司合成；DNA测序由宝生物工程（大连）有限公司完成。如无特别说明，所有的化学试剂均为分析纯产品。

1.2试验方法

1.2.1基因的操作质粒提取、酶切反应、DNA片段回收、连接以及大肠杆菌转化等均参照试剂盒提供的方法进行操作。

1.2.2基因的克隆采用液氮研磨-SDS法提取黄孢原毛平革菌、黑曲霉和白腐真菌总RNA，以合成的cDNA第1链为模板进行PCR扩增，PCR产物经0.8%琼脂糖凝胶电泳进行检测，纯化PCR产物，与PMD-18连接，构建PMD-18-LiP、PMD-18-MnP、PMD-18-gox、PMD-18-Lac质粒，转化E.coli Trans5α感受态细胞，涂布于含150 μg/L 氨苄青霉素、异丙基硫代半乳糖苷（IPTG）、X-gal的LB平板，37 ℃培养过夜。挑取白色菌落，提质粒，PCR验证，对阳性克隆进行DNA序列测定。

1.2.3重组表达载体的构建载体pGAPZαA用EcoRⅠ、KpnⅠ双酶切，产生的3.1 kbDNA片段用DNA回收试剂盒回收纯化。以测序验证正确的含有Lac基因的PMD-18-Lac质粒作模板PCR，PCR片段用EcoRⅠ、KpnⅠ双酶切，1.5 kb片段用上述方法纯化，将片段与用EcoRⅠ/KpnⅠ酶切后的pGAPZαA片段用T4连接酶于16 ℃过夜连接；连接液转化E.coli Trans5α，涂布于含有博莱霉素（Zeocin）（100 mg/L）的LB平板上，37 ℃培养过夜，随机选取转化子提取质粒，PCR分子验证，PCR验证正确的转化子用EcoRⅠ、KpnⅠ双酶切再次验证，将重组质粒送相应公司测序。LiP、MnP、gox、Lac基因表达载体的构建方法一样，只是酶切位点不同，LiP基因的酶切用EcoRⅠ/NotⅠ，MnP基因的酶切用EcoRⅠ/NotⅠ，gox基因的酶切用KpnⅠ/NotⅠ，Lac基因的酶切用EcoRⅠ/KpnⅠ，从而得到表达载体GAPZαA-LiP、pGAPZαA-MnP、pGAPZαA-gox、pGAPZαA-Lac。

1.2.4酶活测定

1.2.4.1木质素过氧化物酶（LIP）酶活的测定[17]2 mL反应体系中含0.4 mL发酵液（或稀释酶液）、10 mmol/L藜芦醇、50 mmol/L酒石酸缓冲液（pH值2.5），加入0.4 mmol/L H2O2 启动反应，30 ℃反应2 min后，以不加发酵液、用蒸馏水补齐的2 mL反应液作对照，用酶标仪在310 nm处测定吸光度D310 nm。

1.2.4.2锰过氧化物酶（MNP）酶活的测定[18]2 mL反应体系中含0.4 mL 发酵液（或稀释酶液）、100 μmol/L MnSO4、0.01%苯酚红、0.1%牛血清蛋白、25 mmol/L乳酸锂、50 mmol/L 酒石酸缓冲液（pH值4.5），加入0.1 mmol/LH2O2 启动反应，于30 ℃反应5 min后，加入100 μL 2mol/L NaOH溶液终止反应，以先加终止剂的作对照，测610 nm处的吸光度D610 nm。

1.2.4.3葡萄糖氧化酶（GO）酶活的测定[19]5 mL反应体系含0.7 mL发酵液（或稀释酶液）、0.04 mol/L葡萄糖、3 mL 0.2 mol/L乙酸-乙酸钠缓冲液（pH值 4）、1.3 mL靛蓝胭脂红溶液（1.0×10-3 mol/L），于37 ℃条件下反应10 min，再于100 ℃水浴13 min，用流水冷却5 min以终止反应，以不加发酵液用蒸馏水补齐的等量体系作对照，测615 nm处的吸光度D615 nm。

1.2.4.4漆酶（LAC）酶活的测定[20-21]3 mL反应体系中含有2.95 mL柠檬酸-磷酸盐缓冲液（pH值3.4）、1 mL 1 mol/L ABTS、0.05 mL稀释后的酶液，于25 ℃反应3 min后，对照为未加ABTS同体积的反应混合液，用酶标仪在420 nm下测定吸光度D420 nm。

1.3毕赤酵母重组菌株的获得及鉴定

将重组质粒用BspH I酶切，使其完全线性化，电击转化至毕赤酵母X33感受态细胞中，感受态细胞及电转化过程参照《Invitrogen公司操作手册》[22]。电转化液均匀涂布到含100 mg/L Zeocin的YPDS培养基上，于30 ℃培养2～3 d至长出重组子。将平板上生长的重组子分别挑取到含有3 mL YPD培养基的24孔板中，于30 ℃、200 r/min摇床培养，漆酶重组菌株培养5 d，木质素过氧化物酶、锰过氧化物酶、葡萄糖氧化酶重组菌株培养3 d，根据上述方法测定酶活。高温裂解高酶活酵母转化子，获得其DNA，以此为模板，用目的基因引物进行PCR扩增，用琼脂糖电泳进行鉴定。

1.4重组菌株对天然木质素玉米皮的酶解

将木质素过氧化物酶、锰过氧化物酶、葡萄糖氧化酶、漆酶的重组酵母工程菌株和转有空质粒的对照酵母菌株于25 mL YPD培养基中30 ℃振荡培养（200 r/min），木质素过氧化物酶、锰过氧化物酶及葡萄糖氧化酶工程菌株培养3 d，漆酶工程菌株及转有空质粒的对照酵母菌株培养5 d，4 000 r/min离心 5 min，得到上清液。取1 mL 5株菌的上清液加入到4mL经0.1 mol/L氢氧化钠溶液预处理的玉米皮上清液中，另各取250 μL木质素过氧化物酶、锰过氧化物酶、葡萄糖氧化酶、漆酶的工程菌株发酵上清液混合，加入到4 mL用0.1 mol/L氢氧化钠溶液浸泡24 h的玉米皮上清液中，置于 30 ℃ 恒温培养箱中降解木质素。用0.1 mol/L氢氧化钠溶液调零，于280 nm处测吸光度D280nm，吸光度的降低值表征木质素的降解量。为了降低误差，平行做3组玉米皮的酶解试验。

2结果与分析

2.1LiP、MnP、gox、Lac基因表达载体的构建及序列测定和分析

LiP基因的纯化回收片段与载体pGAPZαA用EcoRⅠ/NotⅠ酶切，MnP基因的纯化回收片段用EcoRⅠ/NotⅠ酶切，gox基因的纯化回收片段用KpnⅠ/NotⅠ酶切，Lac基因的纯化回收片段用EcoRⅠ/KpnⅠ酶切。T4连接酶于16 ℃过夜连接，连接液转化到感受态细胞E.coli Trans5α，构建pGAPZαA-LiP、pGAPZαA-MnP、pGAPZαA-gox、pGAPZαA-Lac质粒。挑选阳性克隆，提质粒，分别用4种基因的限制性内切酶对构建的质粒进行酶切验证，从图1可以看出，LiP、MnP、gox、Lac基因与载体连接成功；重组阳性质粒pGAPZαA-LiP、pGAPZαA-MnP、pGAPZαA-gox、pGAPZαA-Lac经测序结果表明，LiP基因长1 003 bp，MnP基因长1 100 bp，gox基因长1 963 bp，Lac基因长1 563 bp。将基因序列用DNAclub翻译为氨基酸序列后，在NCBI数据库中进行Blast比对，LiP、MnP基因与黄孢原毛平革菌的同源性达100%，gox基因与黑曲霉的同源性达100%，Lac基因与白腐真菌的同源性达100%，说明构建pGAPZαA-LiP、pGAPZαA-MnP、pGAPZαA-gox、pGAPZαA-Lac成功。

2.2转化与高表达工程菌株的筛选

用电转化方法分别将重组表达载体pGAPZαA-LiP、pGAPZαA-MnP、pGAPZαA-gox、pGAPZαA-Lac和空载体pGAPZαA转化到毕赤氏酵母中，电转化液均匀涂布到YPDS培养基上，Zeocin浓度为100 mg/L，在平板上分别获得转化子。采用24孔板微培养抗性转化子，以酶活性为筛选指标，依据上述测定酶活方法等比例缩小反应体系为200 μL，采用96孔板测定吸光度，筛选阳性转化子。木质素过氧化物酶工程菌株发酵3 d，共筛选了561个转化子，筛选出酶活力较大且酶活稳定的2株工程菌株（表1）；锰过氧化物酶工程菌株发酵3 d，共筛选了632个转化子，筛选出酶活力较大且酶活稳定的5株工程菌株（表2）；葡萄糖氧化酶发酵3 d，共筛选了731个转化子，筛选出酶活力较大且酶活稳定的2株工程菌株（表3）；漆酶发酵5 d，测定酶活，共筛选了863个转化子，筛选出酶活力较大且酶活稳定的3株工程菌株（表4）。

2.3工程菌株的鉴定

筛选出的酶活较高的工程菌株经分离纯化后，用PCR方法对筛选得到的工程菌株进行鉴定，pGAPZαA-LiP转化毕赤酵母X-33所得到的阳性转化子的PCR鉴定结果见图2；pGAPZαA-MnP转化毕赤酵母X-33所得阳性转化子的PCR鉴定结果见图3；pGAPZαA-gox转化毕赤酵母X-33所得阳性转化子的PCR鉴定结果见图4；pGAPZαA-Lac转化毕赤酵母X-33所得阳性转化子的PCR鉴定结果见图5。

2.4单一酶和复合酶对天然木质素的降解效果

玉米皮水溶性差，直接加入降解酶会影响酶的降解效果，OH-能够减弱纤维素与半纤维素之间的氢键，并且皂化半纤维素与木质素分子之间的酯键，使木质素释放出玉米皮结构组织，因此应先将玉米皮用0.1 mol/L的氢氧化钠溶液浸泡24 h。将高酶活表达的木质素过氧化物酶、锰过氧化物酶、葡萄糖氧化酶、漆酶基因的工程菌株发酵液于4 000 r/min离心，取上清液。将4种酶及转有空质粒的对照酵母菌株的上清液分别加入玉米皮上清液中，将4种酶的上清液等比例配

合后也加入到玉米皮的上清液中，置于30 ℃的恒温培养箱中降解木质素，用酶标仪在280 nm处测0、6、12、18、24 h的吸光度，吸光度的下降幅度表征木质素的降解量，详见图6。根据木质素降解造成的吸光度递减数据可知，4种酶均对木质素有一定的降解作用，其中木质素过氧化物酶、漆酶的降解活性高于锰过氧化物酶、葡萄糖氧化酶；木质素与过氧化物酶、锰过氧化物酶、葡萄糖氧化酶、漆酶反应24 h，D280nm的降低幅度分别为45%、39%、9%、57%，复合酶降解木质素的活性明显高于单一酶，D280nm的降低幅度为78%，说明复合酶增强了木质素的降解效率。

3讨论

Raymond报道用Pichia methanolica表达系统表达木质素过氧化物酶，产生的蛋白量达到500 mg/L[23]；国际上亦曾报道毕赤酵母中漆酶基因的最高酶活达到11.5 U/mL[24]；关于锰过氧化物酶基因在Pichia pastoris中异源表达的报道较少，Gu等在2000年发表的会议论文中报道，重组锰过氧化物酶的酶活力为7 U/L[25]。目前，葡萄糖氧化酶的研究主要集中在来源于青霉和黑曲霉的基因，Whittington等在酿酒酵母中成功表达了来源于黑曲霉的葡萄糖氧化酶基因[26-27]；母敬郁等采用瑞式木霉表达了黑曲霉来源的葡萄糖氧化酶基因[28]；国内外的研究人员也在毕赤酵母中成功表达了来源于青霉和黑曲霉的葡萄糖氧化酶基因[29-30]。本研究采用RT-PCR方法克隆了黄孢原毛平革菌（Phanerochaete chrysosporium）来源的木质素过氧化物酶基因（LiP）、锰过氧化物酶基因（MnP），黑曲霉（Asperillus niger）来源的葡萄糖氧化酶基因（gox）及白腐真菌（White Rot Fungi）来源的漆酶基因（Lac），氨基酸序列与NCBI报道的同源性达到100%。

对于木质素降解酶系的异源表达，研究人员尝试了不同的表达系统，包括昆虫杆状病毒表达系统、大肠杆菌表达系统、黑曲霉表达系统以及酵母表达系统[31]。结果表明，相比较而言木质素降解酶系在酵母中的表达比较成功。酿酒酵母是最早用于表达的酵母菌，但它有一定的局限性，因此科研工作者将焦点转移到毕赤酵母上，毕赤酵母有其他表达系统不可比拟的优势，它既有原核生物易于培养、生长速度快、培养基廉价和试验过程简单等特点，而且有强有力的启动子，可对异源蛋白进行加工折叠和翻译后修饰，然后分泌到胞外，具有典型的真核生物表达体系的特点[32]。毕赤酵母表达系统表达量高，易于大规模培养，同时生产成本低，能进行蛋白质翻译后修饰，且生物安全性高，到目前为止已经有超过500种蛋白在毕赤酵母中得到了高效表达[33]。随着毕赤酵母基因测序工作的完成[34]，毕赤酵母的代谢调控信息会更加明晰，所以重组蛋白的毕赤酵母表达系统会得到进一步的发展。本研究分别构建了4种酶的毕赤酵母表达载体，转化宿主X33，采用24孔板微培养转化子，再利用酶标仪测定酶活力，高酶活菌株再做PCR进一步确认，提高了筛选效率，建立了1种简单快速、高通量筛选方法，提高了异源蛋白在毕赤酵母中表达的效率。

本研究利用毕赤酵母成功分泌表达了漆酶、木质素过氧化物酶、锰过氧化物酶和葡萄糖氧化酶，借鉴其他研究者酶活的测定方法，采用特定底物，都分别表现了各自的酶活性。与其他研究者不同的是，本研究采用了玉米皮作为底物，与4种酶的发酵液及其混合液反应，研究其发酵液对天然木质素的降解效果。试验结果显示，4种酶对玉米皮中的木质素成分均有降解作用，而且复合酶的酶活水平比单一酶的酶活明显提高，降解效率提高了2倍左右。木质素降解酶系的协同作用，提高了木质素的降解效率，这在国内外相关研究中未见报道，为探索木质素酶解的新方法、新途径提供了一个全新思路。

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