番木瓜NAC转录因子的克隆与表达分析

杨菲颖 申艳红 耿姣姣 吴用 李科 陈晓静

摘要 为探究番木瓜NAC转录因子的序列特征及功能，以‘大庆7号番木瓜果肉为试验材料，采用RT-PCR克隆出2个不同的NAC类基因，命名为CpNAC1（GeneBank KT364871）和CpNAC2（GeneBank KT372241），其开放阅读框（ORF）长度分别为609bp和805bp，分别编码202个和268个氨基酸，其N端含有NAM保守结构域。采用实时荧光定量PCR研究其在乙烯利及清水对照处理后果实不同成熟时期中的表达情况，结果发现，CpNAC1和CpNAC2基因随着处理后时间的增加，表达量呈先下降后缓慢上升的趋势，且均与果实成熟呈负相关。但CpNAC1表达趋势与果实成熟过程中乙烯的表达量相反，受乙烯抑制降低表达量，从而参与了番木瓜果实的成熟衰老进程，而CpNAC2基因在乙烯处理后番木瓜果实中表达量与对照处理相比没有显著变化，说明CpNAC2基因不是通过乙烯信号传导途径来调控果实成熟。

关键词 番木瓜；NAC转录因子；基因克隆；果实成熟

中图分类号 S667.9

文献标识码 A

Abstract In the present study， two novel NAC genes encoding NAC proteins in papaya， CpNAC1 and CpNAC2 were isolated from papaya fruit. The length of the cDNAs of CpNAC1 and CpNAC2 was 609 bp and 805 bp， encoding 202 and 268 predicted amino acids， respectively. Sequence analysis demonstrated that the CpNAC1 and CpNAC2 proteins contained NAM consecutive structural domain of the NAC superfamily. RT-qPCR analysis demonstrated that the expressing level of CpNAC1 and CpNAC2 dropped first and slowly increased afterward， and was negatively correlated with fruit mature. But the expression of CpNAC1 decreased significantly after ethephon treatment， indicating that CpNAC1 may be related to ethylene signal tansduction pathway. And CpNAC2 transcript levels had no change during ethephon treatment compared to the controls. These results suggests that the expression of CpNAC2 decrease in papaya fruit ripening and softening was not induced by ethylene.

Key words Papaya； NAC transcription factor； Gene cloning； Fruit ripening

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2016.05.008

NAC（NAM、ATAF1/2、CUC2）转录因子是近年发现最大的具有多种功能的植物特异性转录因子。其蛋白最显著的结构特点是N端含有150个氨基酸残基组成的高度保守结构域，C端为高度变异的转录调控区，具有转录激活或抑制活性。研究结果表明，NAC转录因子家族在植物的生长和发育过程中发挥重要作用，包括顶端分生组织的形成，植物形态建成，叶片衰老，胚胎发育，类黄酮生物合成，侧根的发育，次生细胞壁的形成。此外一些研究报道，NAC转录因子参与激素信号传导，包括生长素、乙烯、脱落酸、赤霉素、水杨酸和细胞分裂素等。而且也参与植物对病原菌、真菌等生物的侵染以及干旱、低温、高盐、机械损伤等非生物逆境的抗逆反应。

近年来，NAC转录因子在果实衰老过程中的调控作用被广泛地研究。Kou等研究发现，AtNAP基因对拟南芥长角果的衰老过程具有促进作用。Ma经试验发现，番茄SlNAC1基因通过负调控乙烯的合成和信号转导调节番茄果实的着色，通过正调控ABA合成调节番茄果实成熟。Shan等研究发现，香蕉MaNAC1/2影响乙烯信号途径中下游基因EIN-3的表达，预测可能通过调节乙烯信号途径参与香蕉果实的衰老过程。番木瓜作为具有重要经济价值的果树模式植物，属呼吸跃变型果实且对低温敏感，不利于运输和贮藏，由于NAC转录因子具有降低乙烯信号传导途径，从而延缓果实衰老的功能，目前尚未见到有关番木瓜NAC转录因子的报道，因此，有必要探索番木瓜中NAC转录因子在果实衰老过程的调控机制。本试验以番木瓜为材料，根据植物转录因子数据库PlantTFDB中推测的番木瓜NAC转录因子氨基酸序列，利用RT-PCR等技术克隆NAC基因并对其进行生物信息学分析和表达分析，以期探明NAC在番木瓜果实成熟软化中的功能，为耐贮运，长货架期的番木瓜分子育种提供参考。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1植物材料及菌种 选择表面完好、无机械损伤、大小均匀一致的绿熟期‘大庆7号番木瓜果实为试验材料，在25℃进行乙烯利及清水对照处理，将果实分别用0.5g/L的乙烯利水溶液和清水浸泡3min，自然晾干后，用体积为62.5cm3的泡沫箱装箱密封2h，处理后将果实放在25℃房中储藏。将处理后6、12、24h和3d的番木瓜果实去除果皮和种子，果肉切成2mm×2mm×2mm的块状，用液氮速冻后于-80℃贮存备用。大肠杆菌菌株DH5a为本实验室保存。

1.1.2试剂 ExTaq、dNTPs、18-T载体购自TaKaRa公司，琼脂糖胶回收试剂盒购自北京索莱宝科技有限公司，Super SMART PCR cDNA Synthesis Kit购自BD Biosciences Clontech公司，通用RNA提取试剂盒R1051、SYBR ExScript试剂盒购自广州东盛生物科技有限公司。

1.2方法

1.2.1总RNA提取和反转录 使用东盛生物通用RNA提取试剂盒R1051提取番木瓜果肉RNA，并利用紫外分光光度计Q-5000和琼脂糖凝胶电泳检测浓度和纯度后，参照Super SMART PCR cDNA Synthesis Kit试剂盒说明书，以番木瓜果肉RNA（200ng）为模板合成双链cDNA，于-20℃保存备用。

1.2.2PCR引物的设计与合成 利用植物转录因子数据库PlantTFDB（plant transcription Factor Database）plantffdb.cbi.pku.edu.cn/index.php）]，得到推测的番木瓜（Carica papaya）NAC转录因子家族的82个氨基酸序列，利用NCBI中的tBlastn工具获得番木瓜82个转录因子的编码序列。利用Primer5.0在开放阅读框的两侧设计特异引物（见表1）。引物合成及基因测序工作均由上海铂尚生物技术有限公司完成。

1.2.3番木瓜NAC基因cDNA克隆 以‘大庆7号番木瓜果肉cDNA为模板，进行PCR扩增。反应体系为25μL体系。PCR反应程序为：94℃3min；94℃30s，53℃30s，72℃1min，35次循环：72℃7min。扩增PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测，将目的条带割胶回收，连接18-T载体并转化DH5a，菌液鉴定后测序。

1.2.4生物信息学分析 利用Primer5.0软件进行引物设计：利用DNAMAN软件进行序列拼接和蛋白质翻译：Blastn和Blastx（http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）进行基因及蛋白质同源性搜素：使用Swissport（http：//www.expasy.ch/sprot/）和PFAM（http：//pfam.sanger.ac.uk/）进行氨基酸序列结构域分析：利用SignalP4.1Server（http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP）对氨基酸序列信号肽进行预测：用SOPM法进行蛋白质二级结构分析：用Phyre2（id=index）进行蛋白质三维结构分析：用MEGA 6.0软件的邻接法（Neighbor-Joining，NJ）构建分子进化树。

1.2.5NAC类基因的表达分析 提取500μg/L乙烯利和清水处理后6、12、24h和3d的番木瓜果肉RNA，将逆转录得到的cDNA（500ng/L）稀释3倍作为qRT-PCR的模板，以CpActin为内参，qCpNAC1-F，R和qCpNAC1-F（R分别为2个NAC类基因的上下游引物）检测NAC类基因在番木瓜不同成熟时期不同处理的表达水平，序列见表1。qRT-PCR反应体系为10μL体系：SYBR Mix 4μL，PCRforward primer（10mol/L）0.2μL，PCR Reverse primer（10mol/L）0.2μL，cDNA 1μL，ddH₂O 4.6μL，每个样品4次重复。利用三步法扩增程序：94℃3min，95℃15s，60℃30s，72℃20s。40次循环。将清水处理后6h的表达量作为相对参照。定义为1。采用2^-△△Ct法进行相对表达量的分析，用SPSS19.0进行邓肯氏多重比较。

2结果与分析

2.1番木瓜NAC类基因的克隆与序列分析

以番木瓜果肉cDNA为模板，扩增获得两条条带，与预期基因片段大小一致（图1），挑阳性克隆送检。测序结果显示。2条基因的开放阅读框（ORF）分别为609bp和805bp，共编码202个和268个氨基酸。将2个基因分别命名为CpNAC1、CpNAC2，GenBank登录号为KT364871、KT372241。

2.2番木瓜NAC的生物信息学分析

将CpNAC1、CpNAC2基因的氨基酸序列在NCBI网站上进行CDD搜索（图2），保守结构域分析表明，CpNAC1的N端8～138位氨基酸、CpNAC2的N端26～117位氨基酸，都为NAM保守结构域。利用DNAMAN6.0软件将基因CpNAC1、CpNAC2开放阅读框翻译成氨基酸序列，进行同源序列比对分析，CpNAC1同拟南芥Arabidopsis thaliana（NP_201258.2）、烟草Nicotiana tabacum（XP_009762857.1）、草莓Fragaria vesca subsp.（XP 004309284.1）、葡萄Vitis vinifera（XP_002264894.3）、甜橙Citrus sinensis（XP_006432173.1）、杨树Populus trichocarpa（XP_002310519.1）的同源性分别为97%、99%、100%、100%、100%，CoNAC2同可可Theobroma cacao（XP_007017462.1）、麻疯树Jatropha curcas（XP_012071783.1）、蓖麻Ricinus communis（XP_002510344.1）的同源性分别为97%、98%、100%，说明NAC转录因子氨基酸序列高度保守。

为研究NAC的进化关系，用MEGA6.0软件构建11种高等植物的NAC系统进化树，结果见图3所示，CpNAC1和CpNAC2分别属于2个分支，与CpNAC1亲缘关系最近的是草莓，同属于草本果树。CpNAC2与可可、蓖麻、麻疯树亲缘关系较近。CpNAC1和CpNAC2都与单子叶植物水稻进化距离相对较远。

2.3番木瓜NAC转录因子的蛋白结构预测分析

利用Protparam等在线工具预测2种番木瓜NAC转录因子蛋白的基本理化性质（表2），2种番木瓜NAC都属于亲水性和不稳定性蛋白。经跨膜螺旋分析，CpNAC1的跨膜螺旋数均为0，未形成跨膜区域，不是膜蛋白：CpNAC2在膜内跨膜螺旋数为0，膜外跨膜螺旋数为1，即结合在膜外侧，属于膜蛋白，可能与信号转导相关。2种番木瓜NAC蛋白不存在信号肽。为非分泌蛋白。通过SOPM法对2种番木瓜NAC转录因子家族蛋白进行预测分析，结果表明。CpNAC1由28.71%α-螺旋、16.83%延伸链、9.90%β-转角和44.55%随机卷曲组成。CpNAC2由27.24%α-螺旋、18.28%延伸链、10.45%β-转角和44.03%随机卷曲组成。

以Phyre2工具预测番木瓜2种NAC蛋白的三级结构（图4），可以看出α-螺旋、延伸链、β-转角和随机卷曲的二级结构为折叠方式。CpNAC1和CpNAC2两蛋白具有相似的三级结构，其中CpNAC1较CpNAC2多一个α-螺旋。

2.4CpNAC基因在番木瓜不同成熟时期的表达

试验中观察到乙烯利处理和清水处理24h后的番木瓜果实特征见图5。从图5可见，2个处理从果皮颜色上比较无显著差异，都为绿色，但乙烯利处理的番木瓜24h开始软化，果肉大面积变黄，而此时期清水处理的果肉仍然硬度较大，果肉颜色较浅。

应用qRT-PCR法检测CpNAC在番木瓜中乙烯利和清水对照处理后6、12、24h和3d果实中的表达水平，结果如图6所示，其中CpNAC1和CpNAC2随着处理后时间的增加，表达量呈先下降后缓慢上升的趋势，且表达量均低于6h的对照组，说明这2个转录因子的表达与果实成熟呈负相关。其中，CpNAC1经外源乙烯处理，在24h时表达量达到最低，显著低于清水处理后该时期的表达量，表明该基因的转录水平受乙烯的负调控。CpNAC2表达量在处理后24h最低，不同时期外源乙烯处理的表达量与清水处理变化无显著差异，说明该基因在果实成熟过程受乙烯调控不明显。以上结果说明，CpNAC1表达趋势与果实成熟过程中乙烯的表达量相反，受乙烯抑制降低表达量，从而参与了番木瓜果实的成熟衰老进程，而CpNAC2基因在乙烯处理后番木瓜果实中表达量与对照处理相比没有显著变化，说明CpNAC2基因不是通过乙烯信号传导途径来调控果实成熟。

3讨论与结论

NAC作为最大的植物特异性转录因子家族，在拟南芥和水稻中已有许多NAC类基因被克隆并鉴定出来，本试验首次从番木瓜中分离出了2个NAC类基因CpNAC1，CpNAC2的全长cDNA。根据保守结构域分析，CpNAC1和CpNAC2转录因子的N端为高度保守的NAC结构域。本试验结果丰富了番木瓜NAC转录因子家族成员及其遗传背景。为后人的研究提供理论参考。进化树分析结果表明，CpNAC1和CpNAC2都与单子叶植物水稻进化距离相对较远，CpNAC1与草莓亲缘关系最近，CpNAC2与可可、蓖麻、麻疯树亲缘关系较近。蛋白的三级结构分析发现蛋白结构较相似，但CpNAC1蛋白较CpNAC2蛋白多1个α-螺旋，该结构的差异是否是导致两蛋白功能差异的主要原因尚需进一步研究证实。

果实衰老是一个复杂的生理生化过程，受到众多基因和生物途径调控，包括转录因子的调控。许多转录因子参与了果实衰老过程，如AP2、bZIP、MYB、WRKY、MADS、NAC等。在许多植物中发现，NAC转录因子的表达受到乙烯的诱导和抑制。番木瓜属于典型的呼吸跃变型果实，在果实成熟起始会释放大量的乙烯并且伴随着呼吸速率的迅速增加。为深入了解番木瓜NAC的功能，笔者对番木瓜果实进行了外源乙烯处理和清水处理后不同时间NAC类基因表达量检测。结果说明，CpNAC1、CpNAC2伴随果实衰老，表达量均低于6h的对照组，说明这2个转录因子的表达均与果实成熟呈负相关。Ma等研究发现过表达SlNAC1抑制乙烯释放，延缓果实衰老：Shan等研究中发现MaNAC1、MaNAC2在外源乙烯利的诱导下转录水平大大提升。而CpNAC1表达趋势与果实成熟过程中乙烯的表达量相反，受乙烯抑制降低表达量，CpNAC2基因在乙烯处理后番木瓜果实中表达量与清水处理相比没有显著差异，借此推测，CpNAC1可能通过负调控乙烯的生物合成和信号传导参与果实成熟衰老调控过程，CpNA C2基因不是通过乙烯信号传导途径来调控果实成熟，具体的调控途径还需从转基因等方面进一步研究。

本试验从外源乙烯施加下基因的转录水平角度来初步预测CpNAC1、CpNAC2功能，为进一步深入探讨番木瓜成熟衰老期间转录因子调控机制提供必要的理论参考，为耐贮运，长货架期的番木瓜分子育种提供理论依据。

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