干扰素-γ诱导蛋白-10与慢性乙型肝炎肝纤维化发生发展相关性研究

赵亚娟,赵彩彦,王亚东

(1. 河北省邯郸市传染病医院，河北 邯郸 056001；2. 河北医科大学第三医院,河北 石家庄050051)



干扰素-γ诱导蛋白-10与慢性乙型肝炎肝纤维化发生发展相关性研究

赵亚娟1,赵彩彦2,王亚东2

(1. 河北省邯郸市传染病医院，河北 邯郸 056001；2. 河北医科大学第三医院,河北 石家庄050051)

[摘要]目的通过观察慢性乙型肝炎不同肝纤维化程度患者血清干扰素γ(IFN-γ)、干扰素γ诱导蛋白-10(IP-10)水平及肝组织IFN-γ、IP-10 mRNA及蛋白表达情况，探讨IP-10在肝纤维化发生发展中的作用，为临床肝纤维化无创诊断提供新的思路。方法选择接受肝穿刺组织病理活检的慢性乙型肝炎患者60例，依肝纤维化程度分为S0～1组17例,S2～3组28例,S4组15例；另外选择同期15例肝移植供肝者作为健康对照组。双抗体夹心ELISA法检测各组血清IFN-γ、IP-10水平；免疫组织化学染色观察肝组织中IFN-γ、IP-10阳性表达与分布情况；Real-time PCR法检测肝组织中IFN-γ、IP-10 mRNA表达情况。结果各患者组血清 IFN-γ、IP-10水平及肝组织中IFN-γ、IP-10 mRNA表达量和蛋白表达量均明显高于健康对照组(P均<0.05)，且 S2～3组、S4组明显高于S0～1组(P均<0.05)，S4组明显高于S2～3组(P均<0.05)。结论慢性乙型肝炎患者血清及肝组织中IFN-γ、IP-10水平与肝纤维化程度密切相关，联合检测二者水平有助于慢性乙型肝炎患者肝纤维化的早期诊断和程度评估。

[关键词]慢性乙型肝炎； 肝纤维化；干扰素γ；干扰素γ诱导蛋白-10

乙型肝炎病毒(HBV)感染是一个严重的社会公共卫生问题，目前全世界约有3.5亿慢性HBV感染者[1-2]，每年由于HBV感染相关终末期肝病引起的死亡病例达100余万例[3]。我国2006年HBV感染流行病学调查数据表明，全国1～59岁一般人群HBsAg携带率为7.18%，据此推算，我国现有慢性HBV感染者约9 300万人，慢性乙型肝炎(CHB)患者约2 000万人[4-5]。前瞻性研究证实，CHB患者进展为肝硬化年发生率为2.1%，超过30%的CHB患者将在15年内发展为肝硬化[6]。肝纤维化是CHB进展为肝硬化的必经之路，因此早期评估并阻断肝纤维化发生发展是延缓CHB疾病进展，减少肝硬化、肝癌发生的关键环节。本研究以干扰素γ(IFN-γ)、干扰素γ诱导蛋白-10(IP-10)为靶点，依据CHB患者不同肝纤维化程度分组，通过实时荧光定量PCR、免疫组织化学染色、酶联免疫吸附法检测肝组织及血清 IFN-γ、IP-10水平，初步探讨IFN-γ、IP-10在CHB 肝纤维化发生发展中的作用及其对肝纤维化程度的预测价值。

1临床资料

1.1一般资料研究纳入2009年1月—2010年12月在河北医科大学第三医院感染科、邯郸市传染病医院肝病科同意接受肝穿刺组织病理活检的CHB患者60例，其中男35例，女25例；年龄18～65(37±11)岁；均排除其他原因导致的肝纤维化。CHB的诊断符合中华医学会感染病学分会、肝病学分会联合制定的2010年版《慢性乙型肝炎防治指南》[7]诊断标准。依据2000年版《病毒性肝炎防治方案》[8]中肝纤维化分期标准将全部患者按纤维化程度分为3组： S0～1组17例，男10例，女7例；年龄(36±11)岁。S2～3期28例，男16例，女12例；年龄(37±12)岁。S4期15例，男9例，女6例；年龄(40±9)岁。另外选择同期15例肝移植供肝者作为健康对照组，男8例，女7例；年龄(38±12)岁。本研究方案经医院伦理委员会批准，所有标本采集均征得患者或其家属同意，并签署书面知情同意书。

1.2方法

1.2.1ELISA法检测血清IFN-γ、IP-10水平采用双抗体夹心法检测，操作步骤严格按试剂盒说明书进行。

1.2.2Real-time PCR法检测肝组织中IFN-γ、IP-10 mRNA表达情况参照GeneBank中基因序列设计IFN-γ、IP-10、3-磷酸甘油醛脱氢酶引物，由上海生工生物工程有限公司合成。

1.2.3免疫组织化学染色法观察肝组织IFN-γ、IP-10蛋白表达与分布情况经皮肝穿刺活检或手术切取肝组织，采用Power Vision TM二步法对肝组织标本进行IFN-γ、IP-10免疫组织化学染色，以0.01 mol/L PBS代替一抗作为阴性对照，细胞棕黄着色为阳性表达。

2结果

2.1各组血清IFN-γ、IP-10水平比较各患者组血清IFN-γ、IP-10水平均明显高于健康对照组(P均<0.05)，且S2～3组、S4组明显高于S0～1组(P均<0.05)，S4组明显高于S2～3组(P均<0.05)。见表1。

表1　各组血清IFN-γ 、IP-10水平比较

注：①与健康对照组比较，P<0.05;②与S0～1组比较，P<0.05；③与S2～3组比较，P<0.05。

2.2各组肝组织中IFN-γ、IP-10 mRNA和蛋白表达比较各患者组肝组织中IFN-γ、IP-10 mRNA表达量和蛋白表达量均明显高于健康对照组(P均<0.05)，且S2～3组、S4组明显高于S0～1组(P均<0.05)，S4组明显高于S2～3组(P均<0.05)。见表2。

3讨论

表2　各组肝组织中IFN-γ、IP-10 mRNA和蛋白表达情况比较

注：①与健康对照组比较，P<0.05;②与S0～1组比较，P<0.05；③与S2～3组比较，P<0.05。

肝纤维化是由多种致病因素所致肝内结缔组织异常增生，致使肝细胞外基质(ECM)合成与降解失衡，最终ECM过度沉积的一种损伤修复反应。肝组织学病理检查即肝穿刺活检是明确诊断、衡量炎症及纤维化程度以及判定药物疗效的最重要依据。通过肝穿刺活检明确肝脏组织学变化，了解肝纤维化形成相关细胞与分子信号通路，可阻止甚至逆转肝纤维化进展，因此探索肝纤维化形成机制与发生发展的影响因素、寻求理想的抗纤维化靶点对改善慢性肝炎患者远期预后具有至关重要的意义。

近年来，随着对肝脏炎症、纤维化免疫机制认识深入，多种炎症递质、免疫分子、趋化因子均被证实参与肝纤维化的形成。其中趋化因子在病毒性肝炎发病机制中的作用逐渐引起学术界重视。在诸多趋化因子中，IP-10是1985年由Lumer等首次发现的一类CXC家族趋化因子，也被称为CXCL 10，其主要由IFN-γ诱导产生[9]，通过募集单核巨噬细胞、NK细胞、树突状细胞及活化的T淋巴细胞等强化Th1型细胞免疫效应。IP-10不仅由IFN-γ诱导产生，其可刺激募集的Th1型细胞分泌IFN-γ，形成正反馈式瀑布效应，促进炎症局部IP-10含量不断增加[10]，因此在诱导并放大抗病毒免疫应答及调节肝纤维化环节发挥重要效应。目前关于IP-10对肝纤维化影响研究主要集中在HCV感染，且结论存在争议：Harvey等[11]研究证实，IP-10 mRNA表达水平仅与小叶内炎症活动度有关，与汇管区炎症及纤维化程度并无相关性；Diago等[12]研究证实IP-10水平与肝组织炎症坏死程度均无明显相关性，但晚期肝纤维化患者肝脏及血浆IP-10水平显著升高。然而，乙型肝炎患者IP-10变化特点与肝组织炎症、纤维化关系，以及对抗病毒治疗应答影响等研究国外报道甚少。杨华等[13]研究发现，CHB患者肝组织中IP-10及其特异性受体CXCR3表达均显著高于健康对照组，而且随着肝纤维化程度加重，IP-10、CXCR3水平上升。王健等[14]研究亦证实，乙肝肝硬化患者IP-10、CXCR3表达亦显著高于健康对照人群，而且失代偿期肝硬化患者血清IP-10水平高于代偿期肝硬化。导师课题组前期研究发现，慢性HBV感染者不同临床阶段(慢性HBV携带者、慢性乙型肝炎、慢性乙型重型肝炎)IP-10表达存在显著差异，IP-10不仅与肝组织炎症损伤程度平行，同时与干扰素抗病毒应答密切相关[15]。在上述基础上，本研究进一步探讨了IP-10与CHB肝纤维化发生发展的关系，结果发现，IP-10在肝组织及血清表达水平与INF-γ呈良好一致性，均随肝纤维化进展而逐渐增加。

综上所述，IP-10作为介导IFN-γ诱导免疫病理损伤及抗纤维化重要信号通路之一，虽与肝纤维化发生发展的因果关系尚未未完全明确，但IP-10参与肝细胞及肝内多种免疫细胞间的网络调节，从而在肝纤维化形成过程中不同位点发挥效应，调控肝纤维化的发生发展。结合本研究结论，笔者认为联合检测血清及肝组织中IP-10及IFN-γ水平有助于CHB患者肝纤维化的早期诊断和程度评估，虽然是否可以作为肝纤维化诊断的辅助指标尚需多中心大样本研究证实，但深入了解IFN-γ、IP-10在肝纤维化各个阶段表达规律，明确IP-10对肝纤维化形成的影响，对肝纤维化无创诊断以及临床判定抗纤维化疗效定然具有重要价值。

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Study on the relationship between interferon-γ induced protein-10 and hepatic fibrosis in patients with chronic hepatitis B

ZHAO Yajuan1, ZHAO Caiyan2, WANG Yadong2

(1. The Infectious Diseases Hospital of Handan City, Handan 056001, Hebei, China; 2. The Third Hospital of Hebei Medical University, Shijiazhuang 050051, Hebei, China)

Abstract:Objective It is to observe the levels of serum interferon gamma (IFN-γ), IFN-γinducible protein-10 (IP-10) and the expression of liver tissue IFN-γ, IP-10 mRNA and protein in chronic hepatitis B (CHB) patients with different liver fibrosis, and investigate the role of IP-10 in the occurrence and development of hepatic fibrosis. Methods Sixty CHB patients who received liver biopsy were enrolled and divided into S0～1group with 17 cases, S2～3group with 28 cases and S4 group with 15 cases according to the degree of liver fibrosis. And 15 cases of liver donors during liver transplantations were recruited as the healthy control group. The serum levels of IFN-γ and IP-10 were detected by enzyme-linked immunosorbent assays (ELISA); the expression and distribution of IFN-γ and IP-10 in liver tissue were observed by immunohistochemical staining; and the expression of IP-10 and mRNA IFN-γ in liver tissue was detected by PCR Real-time method. Results The serum IFN-γ and IP-10 levels, and the expression of IFN-γ and IP-10 mRNA and protein in liver tissue in each patient group were significantly higher than those in the healthy control group (all P<0.05), and the levels in the S2～3group and S4 group were significantly higher than those in the S0～1group (all P<0.05), and those in the S4 group was significantly higher than those in the S2～3group (all P<0.05). Conclusion The IFN-γ and IP-10 levels in serum and liver tissue of patients with CHB is closely related to the degree of hepatic fibrosis, combined detection of the two indexes contribute to the early diagnosis and evaluation of hepatic fibrosis in patients with CHB.

Key words:chronic hepatitis B; liver fibrosis; interferon gamma; interferon gamma inducible protein 10

[收稿日期]2015-11-25

[中图分类号]R0512.62

[文献标识码]A

[文章编号]1008-8849(2016)15-1623-03

doi:10.3969/j.issn.1008-8849.2016.15.008

[作者简介]赵亚娟，女，副主任医师，从事传染病研究工作。