高糖及核因子κB通路诱导足细胞上皮间充质转分化的研究

陈晓雯 杜晓燕 刘文婷 陈文静 李红瑜 彭芬芬 陈毅华 龙海波

高糖及核因子κB通路诱导足细胞上皮间充质转分化的研究

陈晓雯 杜晓燕 刘文婷 陈文静 李红瑜 彭芬芬 陈毅华 龙海波

目的：探讨高糖对小鼠足细胞上皮间充质转分化(EMT)与迁移的影响及其分子机制。 方法：以永生化小鼠足细胞株(足细胞)为研究对象，设置正常糖组(5 mmol/L葡萄糖)、甘露醇组(5 mmol/L葡萄糖+25 mmol/L甘露醇)、高糖组(30 mmol/L葡萄糖)、核因子κB(NF-κB)特异性抑制剂小白菊内酯(PTL)+高糖组，作用时间24h。采用Transwell检测细胞迁移能力，Western Blot检测蛋白表达，qPCR检测mRNA表达情况，免疫荧光检测NF-κB入核情况。 结果：与正常糖及甘露醇组比较，高糖刺激足细胞 24h后细胞的迁移能力明显增强(P<0.05)，足细胞特征性蛋白nephrin明显下调(P<0.05)，纤连蛋白(FN)及mRNA表达显著增加(P<0.05)，而E钙黏蛋白(E-cadherin)及其mRNA表达明显下降(P<0.05)。同时，与上述对照组比较，高糖明显上调p-IκBα(P<0.05)下调IκBα(P<0.05)促使足细胞胞质中的NF-κB入核同时上调p-p65的表达；干预细胞PTL后，足细胞的EMT和迁移得到明显抑制(P<0.05)，nephrin蛋白表达明显上升(P<0.05)。 结论：高糖通过激活NF-κB通路诱导足细胞发生EMT及迁移。

高糖 足细胞 上皮间充质转分化 迁移 核因子κB

糖尿病肾病(DN)是糖尿病常见的微血管并发症，主要以进展性的蛋白尿及逐渐下降的肾小球滤过率为特征，是导致终末期肾衰竭的主要病因[1-2]。足细胞是肾小球滤过屏障的重要组成部分，其损伤的严重程度能预测和判断蛋白尿的发生与发展，并可能是早期DN的预测指标[3-5]。近几年越来越多研究表明,足细胞、肾小管上皮细胞等肾脏固有细胞发生上皮细胞间充质转分化(EMT)及随后迁移能力的增强是导致蛋白尿发生和肾脏纤维化的重要原因[6-8]。然而,有关在高糖环境中足细胞是否发生EMT与迁移以及该过程如何调控的研究甚少。本研究旨在探讨高糖环境中足细胞是否发生EMT与迁移及其潜在的调控机制。

材料与方法

细胞株与实验试剂 永生性小鼠足细胞(足细胞)由中山大学附属第三医院娄探奇教授惠赠。DMEM培养液及胎牛血清购自美国Gibco公司，重组小鼠γ干扰素(IFN-γ)购自美国Pepro Tech公司，Transwell小室购自美国康宁公司，抗小鼠纤连蛋白(FN)及抗小鼠E钙黏蛋白(E-cadherin)均购自美国BD公司，抗小鼠p65、抗小鼠p-p65、抗小鼠IκBα、抗小鼠p-IκBα、抗小鼠p65、抗小鼠p-p65及抗小鼠Tubulin均购自美国Cell Signaling Technology公司，HRP-羊抗兔IgG购自美国EarthOx公司，Trizol试剂、荧光二抗AlexaFluor 488购自美国Invitrogen 公司，反转录试剂盒(Code No.RR047A)及SYBR® Premix Ex Taq II Real Time PCR试剂盒(Code No.RR820A)购自日本Takara公司。

实验方法

足细胞培养 足细胞培养分两个阶段：(1)增殖阶段：于33℃、 5%CO2、50 IU/ml重组小鼠 IFN-γ 的条件下诱导足细胞增殖；(2)分化阶段：于37℃、5%CO2、不含IFN-γ的条件下培养10～14d足细胞获得分化表型，即可用于实验研究。

实验分组 (1)设置正常糖浓度组(5 mmol/L葡萄糖)、甘露醇组(5 mmol/L葡萄糖+25 mmol/L甘露醇)、高糖浓度组(30 mmol/L葡萄糖)；(2)小白菊内酯(PTL)干预高糖组(高糖组+10 μmol/L PTL)

Transwell实验 分别将上述各组细胞以5×104/孔接种于Transwell板小室上室，小室外加入500 μl完全培养基。培养24h后，分别取出小室，用PBS轻轻洗3遍后，4%多聚甲醛固定10 min，DAPI染色10 min后于显微镜下计数迁移至微孔膜下层的细胞，每个样本记数10个视野。

Western Blot 上述各组的足细胞培养24h后，预冷的PBS轻轻润洗细胞3遍后，加细胞裂解液RIPA，冰上裂解10 min后刮取细胞蛋白于1.5 ml EP管中12 000 转/min离心20 min,收集上清，定量，蛋白变性后上样，进行SDS-PAGE电泳90 min后湿转至PVDF膜。5%脱脂奶粉封闭1h，分别加一抗FN、E-cadherin、p65、p-p65、IκBα、p-IκBα、Tubulin(稀释浓度均为1∶ 1 000)过夜。次日孵二抗HRP-羊抗兔IgG(1∶ 10 000)室温1h后用ECL化学发光剂在化学发光成像仪上发光并摄像。图像结果采用Quantity One 4.6.2分析软件进行灰度值检测分析。

实时荧光定量PCR 检测mRNA 的表达，上 述各组的足细胞培养24h 后，用Trizol 提取细胞总 RNA 进行反转录及qPCR 检测，反应条件为94℃预 变性2 min，94℃变性15s，60℃退火延伸30s，扩增 40 个循环。引物: FN: 5’-TACGGAGAGACAGGAGGAAATA- 3’( 正向引物) ，5’-GACTACACCATCACCCTGTATG- 3’( 反向引物) ; E-cadherin: 5’-ACCTCTGTGATGGAGGTC- 3’( 正向引物) ，5’-CCACATTCGTCACTGCTA- 3’( 正向引物) ; GAPDH: 5’-AACAGCAACTCCCACTCTTC -3’( 正向引物) ，5’-AATACGGCTACAGCAACAGG- 3’( 反向引物) 。通过2-△△ct法进行统计分析(表示实验组的目的基因的表达相对于对照组的变化倍数)。

免疫荧光 足细胞爬片于已高压消毒的盖玻片上后于六孔板中按照上述实验分组(1)进行干预细胞24h后，预冷PBS轻轻洗细胞3遍，4%多聚甲醛固定10 min，PBS洗去固定液后5% BSA室温封闭30 min，37℃孵一抗p65(1∶ 400)2h，PBS清洗一抗后37℃孵二抗AlexaFluor 488(1∶ 1 000)，PBS清洗二抗后室温孵育DAPI 10 min，荧光显微镜下拍摄观察。

统计学分析 采用SPSS 20.0进行统计分析，所有实验数据均用均数±标准差表示，实验均重复3遍。多个样本均数比较采用One-way ANOVA，两两比较采用LSD，P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

高糖诱导足细胞迁移 由Transwell结果显示，与正常组对比，高糖刺激足细胞 24h后，足细胞迁移能力明显增强，而甘露醇组足细胞迁移不明显，与正常组组相近，提示高糖诱导足细胞发生迁移不受渗透压影响(图1A)。图1B显著高糖环境中发生迁移的足细胞数目为(89±14.0)个，明显高于正常组(9.3±4.0)个与甘露醇组(9.3±1.5)个。

图1 荧光显微镜下迁移的足细胞 DAPI核染色图像(IF,×200)及迁移细胞计数NG:正常糖浓度组;MA:甘露醇组;HG:高糖浓度组;*:与NG组比较,P<0.05

高糖诱导足细胞发生EMT 与正常组比较，高糖组足细胞特征性蛋白nephrin的蛋白表达明显降低，而甘露醇组则无显著性变化，提示高糖对足细胞具有损伤作用(图2A、B)。与正常组相比，高糖组足细胞的间质细胞标志物FN明显升高，而上皮细胞标志物E-cadherin显著降低，甘露醇组则无明显变化，表明高糖诱导足细胞发生EMT而非渗透压(图2A、B)。qPCR结果显示在mRNA水平上，与正常组比较，高糖组FN的mRNA明显升高而E-cadherin的mRNA则明显下降(图2C)，表明高糖不仅从蛋白水平而且从mRNA水平影响足细胞的EMT。

高糖激活NF-κB通路 免疫荧光结果显示，与正常组比较，在足细胞中高糖明显诱导p65蛋白由胞质进入胞核，而甘露醇组p65蛋白仍处于胞质中(图3A)。Western Blot结果显示，与正常组比较，高糖组p-IκBα明显上调而IκBα明显减少，p65蛋白水平无明显变化而p65的磷酸化水平p-p65则明显升高，上述蛋白在甘露醇组无显著变化(图3B、C)。以上结果表明在高糖刺激的足细胞中，NF-κB通路处于激活状态。

图2 高糖刺激足细胞后nephrin及EMT相关蛋白表达EMT：上皮细胞间充质转分化；FN:纤连蛋白；E-cadherin:E钙黏蛋白；NG:正常糖浓度组;MA:甘露醇组;HG:高糖浓度组;Tubulin:内参微管蛋白；*:与NG组比较,P<0.05

图3 荧光显微镜下p65入核情况(IF，×400)及相关蛋白表达NG:正常糖浓度组;MA:甘露醇组;HG:高糖浓度组;*:与NG组比较,P<0.05

NF-κB介导高糖诱导的足细胞发生EMT及迁移 NF-κB特异性抑制剂PTL与高糖共同孵育足细胞 24h后观察到，高糖引起的足细胞迁移明显得到抑制(图4A、B)。同样地，Western Blot结果显示，PTL可明显下调高糖诱导足细胞FN的高表达并上调nephrin及E-cadherin的蛋白表达(图4C、D)。qPCR结果显示,在mRNA水平，高糖显著诱导FN的mRNA高表达，PTL能够明显抑制其表达，同样高糖可下调E-cadherin的mRNA表达，而PTL可上调其mRNA表达(图4E)。以上结果表明NF-κB通路的活化介导高糖诱导的足细胞发生EMT及迁移。

图4 荧光显微镜下迁移的足细胞 DAPI核染色图像(IF，×200)及EMT相关蛋白表达FN:纤连蛋白；E-cadherin:E钙黏蛋白；NG:正常糖浓度组;MA:甘露醇组;HG:高糖浓度组;PLT：小白菊内酯；EMT：上皮间充质转分化；*：与正常组NG比较，P<0.05，#：与高糖组HG比较，P<0.05

讨 论

足细胞损伤是促成DN发生发展的重要原因。然而，足细胞发生什么样的损伤会导致疾病的发生与发展至今众说纷纭，涉及到足细胞的肥大、萎缩、自噬、去分化、凋亡等。近几年越来越多的研究表明，足细胞受到外界刺激时可能会经历一种表型的转化EMT，即失去本身上皮细胞的特征蛋白(nephrin、E-cadherin及ZO-1等)，而获得间质细胞的特征蛋白[如肌间线蛋白(desmin)、成纤维细胞特异蛋白1(fibroblast-specific protein-1)、Ⅰ型胶原(type Ⅰ collagen)及纤维连接蛋白(fibronectin)等][6-7]。这种转化会让足细胞迁移能力增强，易从肾小球基膜上剥脱，导致滤过屏障的破坏进而大量蛋白漏出。然而，足细胞发生EMT进而迁移的潜在机制至今尚不清楚。本研究发现，NF-κB通路介导着高糖诱导的足细胞发生EMT及迁移。我们的结果显示，在高糖刺激下，足细胞迁移能力增强， FN表达上调而E-cadherin表达下调，同时NF-κB通路处于激活状态；干预NF-κB特异性抑制药物PTL后，足细胞迁移与EMT明显得到抑制。这个研究为足细胞迁移与EMT的机制研究提供新的观点，揭示了NF-κB可能是防治DN的一个有效干预靶点。

NF-κB是一种转录因子蛋白家族，在哺乳动物中包括5个亚基：Rel(cRel)、p65(RelA,NF-κB3)、RelB、p50(NF-κB1,前体为p105)、p52(NF-κB2，前体为p100)，起转录激活作用的只有p65、cRel和RelB[9]。由上述亚基中的两个形成的同源和(或)异源二聚体与靶基因上特定的序列(NF-κB位点)结合调节基因转录，其中最常见的NF-κB二聚体是p65/p50， p65主要结合DNA，而p50起辅助作用[10]。一般情况下，NF-κB在胞质中与IκB结合在一起处于稳定状态，外界损伤刺激作用于细胞表面受体后激活IKK复合体(NEMO、IKKα、IKKβ),将IκB磷酸化或(和)泛素化水解后释放出p65/p50并移位至胞核中，与靶基因的NF-κB结合位点即启动子或增强子结合，诱导基因转录，促进细胞因子、炎症因子的产生及细胞增殖与分化等。NF-κB通路的调节紊乱促成了许多免疫炎症性疾病的发生，包括糖尿病[11-13]。NF-κB基因的多态性影响1型与2型糖尿病的易感性及微血管、动脉粥样病变并发症患者的预后[14-16]。高血糖、高血脂、氧化应激及炎症反应等亦可通过激活NF-κB通路促成糖尿病并发症的发生[17]。目前，部分细胞实验与动物实验已表明，DN中高糖通过激活NF-κB通路诱导肾脏或者肾脏固有细胞(系膜细胞、足细胞、内皮细胞)氧化应激与炎症反应，其调控机制主要是IKK、IκBα的磷酸化、IκBα的泛素化等[18-21]。我们课题组前期实验亦发现高糖可通过降解IκBα激活NF-κB促进系膜细胞增生及白细胞介素6、转化生长因子β1等炎症因子的产生，晚期氧化蛋白产物可通过IKK/NF-κB依赖机制诱导足细胞单核细胞趋化蛋白1的表达[22-23]。近年来研究发现，NF-κB通路不仅参与炎症及氧化应激反应，其在肿瘤细胞的EMT及迁移中亦发挥关键作用。Kumar等[24]发现诱导非小细胞性肺癌细胞系EMT时NF-κB通路处于持续激活状态，抑制NF-κB后EMT主要转录因子表达受限，细胞的侵袭与迁移亦得到抑制。Paranjape等[25]报道NF-κB通路是Bmi1调节Nanog表达促成乳腺癌细胞EMT的关键通路。在肾脏相关细胞中，Berzal等[26]发现抑制NF-κB通路可明显减少肿瘤坏死因子相关的细胞凋亡诱导剂(TWEAK)诱导的肾小管上皮细胞连接蛋白的丢失及发生EMT,体内UUO模型小鼠实验亦证明p65的激活与EMT密切相关[27]。Ghiggeri等[28]发现Nephrin的缺失可能是导致人足细胞细胞间连接受损进而发生EMT的重要原因，β-catenin/NF-κB通路可能是其潜在的调节机制。然而，目前有关NF-κB参与高糖诱导足细胞发生EMT及迁移的具体机制尚未完全清楚。本课题组在此次研究中发现高糖刺激足细胞发生EMT与迁移，阻断NF-κB通路后，EMT与迁移可被明显抑制。由此推测，在高糖环境中IκBα被磷酸化与降解而释放出NF-κB/p65入核与靶基因结合调控FN和E-cadherin的表达，从而诱导EMT，足细胞发生EMT后会变得更具活动性，易发生迁移而脱离肾小球基膜，最终导致滤过屏障的破坏、大量蛋白尿的产生。

总而言之，本研究通过高糖刺激足细胞发现高糖诱发足细胞EMT与迁移，激活NF-κB信号通路启动EMT相关基因转录，使足细胞失去上皮细胞的特征，发生迁移，进而导致滤过屏障结构的破坏。这一结果有望为理解足细胞在DN的发生发展中的关键作用及其分子机制提供新的研究依据和启示。

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(本文编辑 青 松 加 则)

High glucose induces podocyte epithelial-mesenchymal transition and cell migration through NF-κB pathway

CHENXiaowen,DUXiaoyan,LIUWenting,CHENWenjing,LIHongyu,PENGFenfen,CHENYihua,LONGHaibo

DivisionofNephrology,ZhujiangHospital,SouthernMedicalUniversity,Guangzhou,Guangdong,510280,China

LONGHaibo(E-mail:longhb1966@163.com)

Objective：To explore the possible molecular mechanism of epithelial-mesenchymal transition (EMT) and cell migration in high glucose (HG)-induced podocytes. Methodology：Immortalized conditional mouse podocytes (MPC5) worked as the research object. Podocytes were divided into HG group (stimulated with 30 mmol/L glucose for 24 hrs), the normal glucose group (5 mmol/L glucose) and the mannitol group were set as control groups. Cell migration was examined by Transwell. The expression of protein was detected by Western blot. The mRNA level of protein was determined by qPCR. The nuclear translocation of NF-κB was observed by immunofluorescence. Results：Compared with the control groups, the cell migration was significantly enhanced (P<0.05), and the specific protein of podocytes’ Nephrin was significantly down-regulated (P<0.05). FN was significantly up-regulated (P<0.05) while E-cadherin was markedly down-regulated (P<0.05) after stimulated by HG for 24 hrs. Meanwhile, HG increased p-IκBα (P<0.05) and decreased IκBα (P<0.05) greatly, then promoted the nuclear translocation of NF-κB and up-regulated phosphorylation level of p65. Moreover, after treatment with the specific inhibitor Parthenolide (PTL), EMT and migration in podocytes were significantly inhibited and the protein level of Nephrin was up-regulated (P<0.05). Conclusion：HG induces EMT and cell migration in podocytes through NF-κB pathway.

high glucose podocyte epithelial-mesenchymal transition cell migration NF-κB

10.3969/cndt.j.issn.1006-298X.2016.02.008

广东省科技计划项目(2013B021800149，2015A020211012)；广州市科技计划项目(201510010137)

南方医科大学珠江医院肾内科(广州，510280)

龙海波(E-mail：longhb1966@163.com)

2015-12-08

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