中、高强度跑台运动对自发性高血压大鼠心肌纤维化的影响

赵 丽，徐安杰

中、高强度跑台运动对自发性高血压大鼠心肌纤维化的影响

赵 丽1，徐安杰2

（1.忻州师范学院体育系，山西忻州034000；2.北京体育大学，北京100084）

目的：对自发性高血压大鼠（spontaneously hypertensive rats，SHR）实施不同强度的运动干预，探讨中、高强度的运动对高血压大鼠心肌纤维化的影响及其可能的基质金属蛋白酶的表达基质。方法：选用3月龄雄性自发性高血压大鼠（SHR）24只，随机分为安静对照组（SHR-C）、SHR中等强度组（SHR-MEX）、SHR高强度组（SHR-HEX），正常雄性WKY大鼠（WKY-C）8只。SHR大鼠运动训练12周，60 m in／day，5 d／周。运动强度：SHR-MEX组坡度0°，18～20m／min；SHR-HEX组：坡度0°，25～28 m／min。隔周测量各组血压，12周后，测量全心质量指数、心肌蛋白胶原的表达以及心肌组织基质金属蛋白酶9（MMP-9）和基质金属蛋白酶组织抑制剂1（TIMP-1）的表达。结果：1）SHRMEX组的收缩压显著低于SHR-C组，SHR-HEX组的收缩压要显著高于SHR-MEX组；2）SHR-C组的全心质量指数显著高于WKY-C组，SHR-MEX组显著低于SHR-C组，SHR-HEX组显著高于SHR-C组；3）SHR组相比于SHR-C组心肌胶原容积分数、I、Ⅲ型胶原蛋白表达显著升高，SHR-MEX组相比于SHR-C组显著降低，SHR-HEX组相比于SHR-C组显著升高；4）SHR-C组相比于WKY-C组MMP-9以及MMP-1／TIMP-1显著升高，SHR-MEX组相比SHR-C组显著降低，SHR-HEX组相比SHR-C组显著升高。结论：中等强度运动对大鼠心肌纤维化的改善要好于高强度运动，其中MMP-9与TIMP-1的表达平衡可能是其重要机制之一。

高血压；心肌纤维化；基质金属蛋白酶；运动强度

高血压是影响人类健康的慢性病，是以体循环动脉血压（收缩压和／或舒张压）增高为主要特征，并可伴有心、脑、肾等器官的功能或器质性损害的临床综合征，是心脑血管疾病的高危因素。高血压性心脏病是指左心室应力增加导致的心脏反应性的病理生理变化，随着血压的升高，心脏后负荷增加，造成心肌细胞肥大，同时心室壁的厚度与非心肌细胞成分也会发生变化，最终引发心肌纤维化。

心肌纤维化（CF）指心肌组织中胶原纤维过量沉积，胶原浓度和胶原容积分数显著增加，心肌细胞间质Ⅰ、Ⅲ型胶原的大量增生、改建以及比值发生改变［1］。心肌胶原容积分数CVF（胶原面积与心肌总面积的百分比）的变化是心室重构的主要表现之一。基质金属蛋白酶（MMPs）／基质金属蛋白酶组织抑制剂（TIMPs）的表达对于胶原代谢的平衡是至关重要的。MMPs是降解细胞基质中的蛋白成分，TIMPs是MMPs内源性生理抑制剂。MMPs和TIMPs的异常表达与MMPs／TIMPs比例的失调是心室重构的直接原因［2］。许多研究证实：MMPs-9和TIMPs-1的表达量与心肌纤维化水平具有较强的相关性，是检测心肌纤维化的生物标志物。2007年美国运动医学会（ACSM）提出“运动是良医”的理念之后，运动锻炼作为预防慢性疾病的一种非药物性治疗手段越来越受关注。大量的文献已经证实，长期的中低强度运动可以很好地减缓高血压病情的发展［3］。然而此类运动是否可以改善高血压性心肌纤维化，还没有充分的科学报告。

综上，通过选用3月龄雄性自发性高血压大鼠12周的不同运动强度干预，检测大鼠的动脉血压变化、心肌纤维化程度以及相关基质金属蛋白表达，旨在探讨不同强度的运动对自发性高血压大鼠心肌纤维化的影响，并进一步探究大鼠心肌纤维化的作用机制。

1 研究对象与方法

1.1 实验对象

选用3月龄正常雄性大鼠（WKY）6只和自发性高血压大鼠（SHR）24只为本实验的研究对象（维普利华公司，北京）。实验动物分笼饲养，每笼3只，自由进食饮水，两天换一次垫料以保持笼内清洁与干燥，动物的饲料采用国家标准啮齿类动物饲料。大鼠自购买后，适应环境数天，进行有氧运动以适应跑台。运动方案为15 m／min，每次训练持续5 min，连续进行5 d训练。随后，将SHR随机分为安静对照组（SHR-C）、中等强度组（SHR-MEX）、高强度组（SHR-HEX），每组8只。

1.2 运动方案

运动方案采用鲁妮［4］的实验方案，具体训练方案：SHR-MEX运动方案，坡度为0°，速度为18～20 m／min，每周连续5 d跑台运动，每次跑台训练持续60min，周六周日不训练，持续12周；SHR-HEX运动方案，坡度为0°，速度为25～28 m／min，每周连续5 d跑台运动，每次跑台训练持续60 min，周六周日不训练，持续12周。

1.3 主要试剂及溶剂配置

天狼星红染液亦为国产。TIMP-1多克隆抗体购自武汉博士德试剂公司，单克隆抗体Anti-MMP9 antibody购自Abcam，单克隆抗体Anti-GAPDH antibody购自Santa Cruz。辣根过氧化物酶标记山羊抗兔Ig、辣根过氧化物酶标记山羊抗鼠购自Protein tech group。Tris与甘氨酸等Western Blot制胶材料均购自北京雁栖湾试剂有限公司。

Western Blot测试各试剂配制具体方法：0.5Tris：3.028 g Tris碱溶于40m l双蒸水中，加浓盐酸调PH至6.8，双蒸水定容至50 m l。1.5 M Tris-HCL：9.085 g Tris碱溶于40 ml双蒸水中，加浓盐酸PH调至8.8，双蒸水定容50 m l。电泳缓冲液：Tris碱3.03 g，甘氨酸14.41 g，SDS 1 g，双蒸水溶解后定容至1 L，4摄氏度保存。转膜缓冲液：Tris碱3.03 g，甘氨酸14.41 g，10%SDS 1 ml，无水乙醇200 ml。双蒸水定容1 L。

1.4 血压测定

那女子自然也走了。王爷对她的痴迷她不知道。王爷也从没想过让她知道。王爷有自己老婆的，漂亮、贤惠，且村里出了名的心好。几十年苦了累了她都不离不弃地相跟着，王爷怎能生出其他妄念!那戏班子女子，他不过是被她一身的戏气暂时给迷住了，待那“暂时”一过，除生活中多了木偶牵绊他，日子还是原来踏踏实实的日子。要不别人怎么总说，王爷这人，年轻时长得俊，又那么能干那么能守得家，他媳妇简直是得着大便宜了。

在运动干预的12周中每两周采用智能无创血压计测鼠仪BP-2010A（软隆生物技术有限公司，北京）测试大鼠尾动脉血压。

1.5 全心质量指数测定

各组动物在最后一次运动后24 h内取材。采用戊巴比妥钠（50 mg／kg）腹腔注射麻醉，断头开胸迅速取出心脏，利用4℃的生理盐水冲洗，用电子天平称重，计算全心质量指数。其中体重以克（g）为计量单位，心重以毫克（mg）为计量单位。

1.6 心肌胶原溶剂分数（CVF）及I、Ⅲ型胶原蛋白含量测定

心脏称重后，取左心室，使用4%多聚甲醛固定，固定后用流水隔夜冲洗12 h。常规石蜡包埋，纵切组织，切片厚度为6 um：烤片2 h，取切片，脱蜡至水：天狼星红染色滴染1 h，入无水乙醇迅速分化数秒钟，洗去表面浮色，Mayer苏木素染色染液细胞核8～10 min，流水洗去浮色10 min；常规脱水透明，中性树胶封片。天狼星红染色法（Sirius Red染色）可使胶原纤维呈红色，偏光下I型胶原呈红色或者黄色，Ⅲ型胶原呈绿色。应用显微镜计算机辅助图像分析系统（Image-pro PLus6.0），随机分析5个视野，取平均值，计算心肌间质胶原容积分数CVF（CVF为胶原面积与心肌总面积的百分比），用偏正光显微镜观察I、Ⅲ胶原表达。

1.7 MMP-9、TIMP-1蛋白表达Western Blot法测定

取大鼠心尖，用锡箔纸包住心尖，先放入液氮中，后放入－80℃冷冻保存。在Western Blot实验前，制备所需样品，先将心尖置于液氮中研磨成粉状，然后加入细胞裂解液孵育30 min，1 200 rpm低温离心30 min，取上清液。用Bradford法测定蛋白浓度，计算调整上样量后，样品于99℃水中煮5 min。经电泳转膜将蛋白转至PVDF膜上，用5% BSA孵育2 h，并加一抗（anti-timp-1，1：300；antimmp-9，1：1000：anti-gapdh，1：1000）4℃孵育过夜，第二天待复温后加二抗（anti-rabbit IgG-HRP，1：10000，anti-mouse IgG-HRP，1：10000）孵育1 h。滴加ECL，发光后置于Bio-Rad ChemiDOC XRS＋，曝光，计算灰度值。实验于北京体育大学运动生理实验室完成。

1.8 数据分析

以Mean±SEM表示实验测量结果，应用SPSS 19.0进行数据统计，采用GraphPad制作统计图，用单因素方差分析（ANOVA）：P＜0.05有显著差异，P＜0.01有极显著差异。n表示实验的样本量。

2 结果

2.1 大鼠体重、心重和全心质量指数

如表1所示：高血压安静组（SHR-C）与正常血压安静组（WKY-C）相比，体重有显著性的减小（332.8±23.7 vs.358.9±25.4，P＜0.05），全心质量指数有了显著性的增加（3.81±0.27 vs.3.46± 0.19，P＜0.01）。高血压中等强度运动组（SHRMEX）与高血压安静组（SHR-C）相比，在体重上有显著性减小（327.8±18.7 vs.332.8±23.7，P＜0.05），在心脏质量上也有显著性的减小（358.9± 25.4 vs.1.24±0.04，P＜0.05），而且全心质量指数也有显著性减小（3.55±0.20 vs.3.81±0.27）。高血压高强度运动组（SHR-HEX）与高血压安静组（SHR-C）相比，虽然心脏质量上没有显著性变化，但是体重存在显著性差异（319.1±14.0 vs.332.8± 23.7，P＜0.01），全心质量指数也有显著性的增加（4.16±0.13 vs.3.81±0.19，P＜0.01）。

表1 各组大鼠的体重、心重和全心质量的比较

2.2 大鼠收缩压的变化

高血压安静组（SHR-C）与正常血压安静组（WKY-C）相比，收缩压有明显的升高（205.5±2.33 vs.138.5±2.04，P＜0.01），高血压中等强度运动组（SHR-MEX）与高血压安静组（SHR-C）相比，收缩压也有显著性的降低（192.8±3.37 vs.205.5±2.33，P＜0.01），高血压高强度运动组（SHR-HEX）与高血压安静组（WKY-C）相比，显著性同样明显（210.2± 4.56 vs.138.5±2.04，P＜0.01）。但高血压中等强度组（SHR-MEX）与高血压安静组（WKY-C）相比，存在显著性的升高（210.2±4.56 vs.205.5±2.33，P＜0.05）（表2）。

表2 各组大鼠的收缩压比较

2.3 心肌胶原溶剂分数（CVF）及I、Ⅲ型胶原蛋白含量测定

普通光镜下观察（表3和图1）：高血压安静组（SHR-C）与正常血压安静组（WKY-C）相比，心肌胶原容积分数（CVF）有极显著性的升高（9.74±1.55 vs.5.61±1.69，P＜0.01）；高血压中等强度运动组（SHR-MEX）与高血压安静组（SHR-C）相比，CVF有显著性的降低，（8.43±0.86vs.9.74±1.55，P＜0.05），高血压高强度运动组（SHR-HEX）与高血压安静组（WKY-C）相比，有显著性的升高（11.01± 2.42 vs.9.74±1.55，P＜0.05）。

偏光显微镜下（图2）高血压安静组（SHR-C）与正常血压安静组（WKY-C）相比，I、Ⅲ型胶原蛋白表达显著性的升高；高血压中等强度运动组（SHRMEX）与高血压安静组（SHR-C）相比，I、Ⅲ型胶原蛋白表达显著性的降低，高血压高强度运动组（SHR-HEX）与高血压安静组（WKY-C）相比，有显著性的升高。

表3 各组大鼠心肌胶原容积分数（CVF）比较

图1 中、高强度跑台运动对大鼠心肌胶原纤维的影响（普通光镜下）

图2 中、高强度跑台运动对大鼠心肌I、Ⅲ型胶原蛋白表达的影响（偏正光显微镜）

2.4 大鼠MMP-9和TIMP-1蛋白的表达

高血压安静组（SHR-C）与正常血压安静组（WKY-C）相比，MMP-9有明显的升高（1.73±0.08 vs.1.00±0.00，P＜0.01），TIMP-1也存在显著性升高（1.26±0.06 vs.1.00±0.00，P＜0.01），MMP-9与TIMP-1的比值同样显著性升高（1.29±0.07 vs.1.00±0.00，P＜0.01）。高血压中等强度运动组（SHR-MEX）与高血压安静组（SHR-C）相比，MMP-9有显著性的降低（1.31±0.38 vs.1.73±0.08，P＜0.01），MMP-9与TIMP-1的比值显著降低（1.02± 0.08 vs.1.29±0.07，P＜0.01）。高血压高强度运动组（SHR-HEX）与高血压安静组（WKY-C）相比，MMP-9显著降低（1.43±0.06 vs.1.73±0.08，P＜0.01），TIMP-9显著降低（0.91±0.18 vs.1.26± 0.06 P＜0.01），但MMP-9与TIMP-1的比值却显著升高（1.51±0.29 vs.1.29±0.07 P＜0.01）。

表4 各组大鼠心肌MMP-9、TIM P-1、MM P-9／TIMP-1比较

3 讨论

目前，已经有大量研究证明，长期规律的有氧运动可以很好地改善高血压患者的病情，在一定程度上延缓收缩压的上升，然而有氧运动的强度也需要控制在一定范围内才能更好地延缓高血压病情的发展。Roy J.Shephard［5］指出通过中等强度的运动可以改善心血管系统及降低血脂。Tipton CM［6］等人的研究证明，自发性高血压大鼠通过长期的40%～60%最大摄氧量强度进行有氧运动训练，可能出现血压下降及心血管系统改善。本实验的研究结果表明，通过12周规律的运动干预，中等强度运动对高血压大鼠收缩压有着明显的改善，这一点与前人的实验研究结果相吻合。

图3 中、高强度跑台运动对大鼠心肌组织MMP-9、TIMP-1蛋白表达的影响

心肌纤维化是心肌因受损、炎症、衰老、细胞凋亡等因素使心肌细胞间质中胶原纤维增多，沉积，胶原浓度升高或胶原容积分数（CVF）显著增加；是心脏发展到一定阶段的病理改变。心肌间质重构以Ⅰ、Ⅲ型胶原为主，Ⅰ型胶原决定心肌的僵硬度而Ⅲ型胶原则决定心肌的顺应性［7－8］。目前已有研究证明：长期的中低强度运动可以使心脏结构和功能发生适应性变化，主要表现在运动性心肌肥大，心肌厚度增加，收缩力增强。Kwak等［9］研究发现，运动可以显著降低了老龄大鼠左心室Ⅰ型胶原m RNA和蛋白的含量，提示运动抑制了Ⅰ型胶原蛋白的合成，心肌僵硬度降低。Derumeaux等［10］指出运动可使小鼠的心肌收缩和舒张功能也得到明显改善，显著降低了心肌内膜胶原蛋白含量及其纤维化程度。本实验中，通过分析心肌胶原容积分数，结果发现高血压大鼠的心肌胶原分数相比正常血压组存在显著性升高，通过长期的中等强度的有氧运动，高血压大鼠的心肌胶原分数可以得到一定的改善，然而长期大强度的有氧运动对心肌胶原容积分数的效果不佳。

正常生理状态下，心肌间质胶原蛋白的合成与降解处于平衡状态。基质金属蛋白酶MMP降解细胞基质中的蛋白成分，TIMPs是MMPs内源性生理抑制剂，TIMPs与MMPs结合抑制其活性，维持胶原蛋白的动态平衡。MMPs／TIMPs比例失调或MMPs表达及活性的增强是导致心室重建、心肌纤维化的直接原因［11］。尹懿等［12］研究证实，MMP-9的表达与心肌纤维化的程度成正相关。MMP-9与TIMP-1的表达，尤其是MMP-9与TIMP-1的比值降低，对心室的重建和大鼠心梗模型的梗死面积有积极影响［13］。Tao［14］等研究表明：MMPs／TIMPs的正常化是心肌纤维化好转的重要因素。本实验研究结果显示，高血压大鼠心肌中的MMP-9的蛋白含量显著高于正常血压组，中等强度和高强度的运动都可以降低高血压大鼠的MMP-9的蛋白相对含量，但是高强度的运动会造成TIMP-1含量下降，从而使MMPs与TIMPs的比值显著升高，间接打破了胶原代谢的动态平衡，最终造成新合成的胶原不能降解而大量沉积。总体来说，中等强度的有氧运动可以很好地降低MMP-9与TIMP-1的比值，改善心肌纤维化的深度，高强度的运动反而会升高MMP-9与TIMP-1的比值，改善心肌纤维化效果不佳。

4 结论

长期中等强度的运动对大鼠心肌纤维化的改善要优于长期高强度的运动，其中MMP-9与TIMP-1的表达平衡可能是其重要机制之一。

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责任编辑：郭长寿

Effect of M edium and H igh Intensity Treadm ill Exercises on M yocardial Fibrosis in Spontaneous Hypertensive Rats

ZHAO Li1，XU Anjie2
（1.Physical Education Department，Xinzhou Teachers College，Xinzhou 034000，Shanxi，China；2.Beijing Sport University，Beijing 100084，China）

Objective：Taking themedium and high intensity treadm ill exercises to be an intervention onmyocardial fibrosis in spontaneously hypertensive rats（SHR），the authorsw ant to investigate the effect of this kind of intervention and to explore the underlying mechanism of expression ofmatrix metalloproteinase.Methods：24 males SHR ratswere random ly divided into 3 groups：sedentary group（SHR-C），middle intense exercise group（SHR-MEX），high intense exercise group（SHR-HEX）and therewere22malesWKY rats（WKY-C）.SHR-MEX underwent treadmill training at18-20m／min for60 m inutes，5d／week，for 12 weeks.SHR-HEX underw ent treadm ill 25－28m／m inutes，5d／week，for 12 weeks.A fter 12 weeks，blood pressure，heartmass index，the expression of myocardial collagen fiber，and the protein expression of matrix metalloproteinase-9 and tissue inhibitor ofmetalloproteinase-1 were examined.Result：（1）The SBP in SHR-C group was significantly lower than that in SHR-C group，but the condition wasquite opposite in SHR-HEX group whose SEPw as significantly higher than the SEP in SHR-C group；（2）The heartmass index in SHR-C group w as significantly higher than that in WKY-C group，the heartmass index in SHR-MED group was significantly lower than that in SHR-C group，but the heartmass index in SHR-HEX was higher than that in SHR-C group significantly；（3）The CVF，expression of I、Ⅲcollagen fibril in SHR-C group w as significantly higher than that in WKY-C group，and these index in SHR-MEX is lower significantly，compared w ith that in SHR-C group，the CVF，expression of I、Ⅲcollagen fibril in SHR-HEX group was higher than that in SHR-C group significantly；（4）The MMP-9 and the rate between MMP-9 and TIMP-1 in SHR-C group were significantly higher than that in WKY-C group.A lso，these indexes in SHR-MEX group were lower that these in SHR-C group.Oppositely，the MMP-9 and rate between MMP-9 and TIMP-1 in SHR-HEX group were higher than these in SHR-C group.Conclusion：them iddle intensity of aerobic exercise has a better fucntion about the improvement ofmyocardial fibrosis in ratswhich are spontaneously hypertensive，and the balance between MMP-9 and TIMP-1 is highly possible to be one of the importantmechanisms for it.

hypertension；m yocardial fibrosis；matrix metalloproteinase；exercise intensity

G804.2

A

1004－0560（2016）06－0071－05

2016-11-09；

2016-12-07

国家体育总局全民健身领域课题（2015B035）。

赵 丽（1980—），女，讲师，硕士，主要研究方向为运动人体科学。