骨髓间充质干细胞对脊髓损伤大鼠的治疗作用

蒋显锋，汤锋武，陈旭义，张赛

骨髓间充质干细胞对脊髓损伤大鼠的治疗作用

蒋显锋1,2，汤锋武1，陈旭义1，张赛1

目的：研究脊髓损伤（SCI）后的不同时间点尾静脉移植大鼠骨髓间充质干细胞（BMSCs）对大鼠SCI的修复作用。方法：SD大鼠24只，制备大鼠SCI模型，随机分为3组各8只：对照组于SCI后尾静脉注射生理盐水；24 h移植组和于7 d移植组分别于SCI后24 h、7 d尾静脉注射BMSCs缓冲液（2×106/mL）1 mL。在SCI后各时间点分别进行Basso Beattie Bresnahan（BBB）运动学评分，于第42天处死动物，HE染色观察SCI处空洞面积的改变情况。结果：7 d移植组大鼠SCI后14、21、28、35、42 d的BBB评分明显高于24 h移植组和对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）。HE染色显示各组SCI部位形成脊髓空洞，7 d移植组大鼠的脊髓空洞明显小于24 h移植组和对照组。结论：BMSCs可在体外培养、扩增，能通过尾静脉注射的方式迁移到SCI部位，促进SCI大鼠的神经功能恢复；移植的最佳时间在损伤后7 d左右。

骨髓间充质干细胞；脊髓损伤；细胞移植

骨髓间充质干细胞（bone marrow stromal cells，BMSCs）是多功能的，能够自我更新的细胞[1]。许多研究表明BMSCs有潜能分化成不同胚层的组织，包括骨、软骨、脂肪和肌肉等[2]。除此之外，许多新的研究报道BMSCs能分化成神经元样细胞，表达多种神经元标记和具有神经元的功能活性[3]。BMSCs取材方便，可进行自体移植，无需担心免疫排斥问题。脊髓损伤（spinal cord injury，SCI）动物模型移植BMSCs后显示明显的功能和行为学的恢复。此外，由于自身的特性和高可塑性，采用BMSCs作为成人干细胞基础的治疗被认为是一种有益的干细胞治疗方式。人BMSCs在神经障碍性疾病治疗中的应用可能更加有优势，包括SCI[4]。本实验通过在SCI后不同的时间点静脉移植BMSCs，研究静脉移植是否能促进SCI的恢复及选取适宜的移植时间。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 健康1月龄SPF级雄性SD大鼠5只，体质量100～120 g；健康成年SPF级SD大鼠24只，体质量200～250 g，均由我院动物实验中心提供，实验动物质量合格证号：SCXK2011-0008。所有大鼠饲养于我院动物实验中心SPF级实验室，由专人照料。

1.1.2 主要试剂和仪器 MASCIS撞击仪（购于美国纽约大学）；倒置显微镜（购于日本Olympus公司）；水平离心机（购于美国Heraeus公司）；IOTEMP220水浴箱（购于美国Fisher公司）；CO2细胞培养箱（购于美国Heraeus公司）；pH计（购于美国Mettler-Toledo公司）；超净工作台（购于上海净化设备厂）；流式细胞仪（购于美国Beckman-Couiter公司）；低糖DMEM细胞培养基（购于美国Gibco公司）；胎牛血清（购于杭州四季青公司）；小鼠抗CD34、CD45、CD44、CD29单克隆抗体（购于美国Invitrogen公司）；5'-溴尿嘧啶核苷 (BrdU)MP（购于美国Biodesign公司）；胰蛋白酶（购于美国Gibco BRL公司）；HE染液（购于珠海贝索生物技术公司）；茜索红、油红O（购于美国Sigma公司）；成骨诱导分化培养液、成脂诱导分化培养液（购于广州赛业公司）。

1.2 方法

1.2.1 BMSCs的分离和原代培养 参照文献[2]，5只1月龄大鼠，急性脱臼处死后，75%乙醇浸泡5 min，在超净工作台下用灭菌的显微手术器械解剖双后肢，分离双侧后肢股骨及胫骨，去除肌肉和筋膜，在含PBS的无菌玻璃平皿中清洗2次，剪去包括骺板在内的两端，用10 mL注射器抽取适量BMSCs，标准培养基反复冲洗骨髓腔入离心管，直至骨髓腔变白为止。细胞悬液置入离心机中以1 000 r/min离心5 min后，小心去除上清液。在倒置相差显微镜下观察细胞形态及生长状况。

1.2.2 BMSCs的传代培养 当原代细胞生长至80%左右融合时，进行细胞传代培养。吸出细胞培养液，用PBS液洗涤2次，清除不贴壁的细胞，加入2.5 g/L胰蛋白酶（含0.2 g/LEDTA）约1 mL室温下消化1～2 min。在倒置相差显微镜下观察，待大部分细胞开始皱缩、细胞形态逐渐变圆时，吸去胰蛋白酶，加入含10%FBS的低糖DMEM培养液终止消化。用吸管反复吹打，在显微镜下观察，待大部分细胞冲洗下来后，将细胞悬浮液移入离心管中，以1 000 r/min离心5 min后弃去上清，PBS重悬后再离心洗去混有的胰蛋白酶。加入细胞培养基重悬，然后按1∶2比例传代接种，标记为P1，置入5%CO2、37℃、95%饱和湿度的细胞培养箱内，倒置相差显微镜下继续观察，待细胞接近80%左右融合时，重复以上传代培养步骤，反复传代扩增。

1.2.3 BMSCs细胞表型的检测 选取P3代生长良好的BMSCs，弃去培养基，用PBS洗涤2次，加入0.25%胰蛋白酶液室温下消化细胞，以1 200 r/min室温离心5 min，弃上清，加PBS轻轻吹打制成单细胞悬液，倒置显微镜下计数，并调整每个检测样本的细胞数为1× 106，分装至EP管，1 200 r/min室温离心5 min，弃上清，于待检测的样本中各加入90 μL PBS重悬，分别加入CD34、CD29、CD44、CD45等FITC、PE抗体及其同型对照各10 μL，室温避光温育30 min，PBS离心洗涤后加PBS 500 μL，充分混匀，流式细胞仪检测样本。

1.2.4 BMSCs向成骨、成脂细胞的诱导分化 选取P3代生长良好的BMSCs细胞，常规消化传代后，以5× 104/mL密度接种于6孔培养板，常规培养待细胞约80%融合，诱导培养基分别换成骨诱导分化培养液（普通培养液中加10-7mol/L地塞米松、抗坏血酸50 mg/L和10 mmol/L β-甘油磷酸钠）及成脂肪诱导分化培养液（普通培养基中加地塞米松10-6mol/L、胰岛素10 mg/L、3-异丁基-1-甲基黄嘌呤0.5 mmol/L、吲哚美辛0.2 mmol/L），对照加入等量普通培养液，每 3 d换1次液。成骨诱导在21 d后进行茜索红染色，成脂肪诱导在14 d后进行油红O染色，染色前均进行4%多聚甲醛固定。置于显微镜下观察并拍照。

1.2.5 大鼠SCI模型的制作 成年大鼠24只，2%戊巴比妥钠（45 mg/kg）腹腔注射麻醉，剃去背部毛发，75%酒精消毒铺巾，在无菌条件下切开皮肤、分离皮下组织及肌肉至椎板和棘突完全暴露。用咬骨钳咬去棘突，轻轻咬除T10椎板，暴露出脊髓（直径约2.5 mm的圆形开口），将大鼠固定于MASCIs撞击仪上，按高度25 mm、物质量10 g撞击棒自由落体撞击暴露的脊髓处，以后肢出现痉挛及鼠尾痉挛性摆动视为造模成功，分层缝合。术中注意维持大鼠体温，术后常规给予补液和庆大霉素（5 mg/kg）3 d[9]，每天帮助排尿、排便2～3次，直至第5天恢复自主排尿、排便。大鼠均无并发症发生。

1.2.6 实验动物分组 24只大鼠随机分为3组各8只：对照组于SCI后尾静脉注射生理盐水；24 h移植组和7 d移植组分别于SCI后24 h或7 d尾静脉注射BMSCs缓冲液（2×106/mL）1 mL。

1.2.7 大鼠后肢运动功能的评定 两名非实验组成员按照Basso Beatlie Bresnahan（BBB）评分标准，在SCI后第7、14、21、28、35、42天对大鼠的后肢进行评分，每次记录前让大鼠在平坦开阔房间自由活动5 min，对每次观察的单个大鼠单独评分后取平均值。总分为21分，7分评判动物后肢各关节运动，6分评判恢复的步态及协调运动，8分评判运动时爪的精细运动。

1.2.8 HE染色 SCI后42 d断头法处死大鼠，取其损伤部位脊髓，切片，二甲苯脱去石蜡，接着经由由高浓度到低浓度酒精，最后入蒸馏水，行HE染色。

1.3 统计学处理

采用SPSS17.0统计软件分析数据，计量结果以（均数±标准差）表示，方差分析，t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 BMSCs的培养

刚分离的SD大鼠骨髓细胞显微镜下多为悬浮小圆细胞，培养24 h可见少量细胞贴壁。48 h首次换液，贴壁细胞明显增多，贴壁细胞为圆形、椭圆形，有突起，集落样生长，见图1A。7～8 d左右细胞铺满约80%的培养瓶底部，细胞融合为单层，形态为纺锤形或不规则形。P2代以后细胞纯度不断提高，形态较为单一，多为长梭形，呈放射状排列，有散在似成纤维细胞样分布，见图1B。

图1 BMSCs培养48 h（A）和第3代（B）的形态学观察（×10）

2.2 BMSCs表面标记物的鉴定

经流式细胞仪检测培养P2代的BMSCs，结果显示CD44阳性率98.1%，CD29阳性率100%，CD34、CD45表达阴性，见图2。

图2 CD29（A）和CD44（B）在P2代BMSCs中表达

2.3 BMSCs诱导分化能力的鉴定

成骨诱导：诱导21 d后可见橘红色矿化结节形成，见图3A。成脂诱导：诱导2周后，可见细胞体积较前增大为类圆形或不规则形，细胞浆内有大小不一红染的脂滴，有的脂滴占据整个细胞的大部，细胞核减小或挤向一边，见图3B。

图3 BMSCs的成骨诱导（A）及成脂诱导（B）（×100）

2.4 SCI后大鼠行为学的观察

造模成功后3组均无大鼠死亡等造成的脱落。7 d移植组的BBB评分从损伤后的14～42 d高于24 h移植组和对照组（P＜0.05），24 h移植组与对照组的评分差异无统计学意义（P＞0.05）。各组大鼠的后肢功能均有不同程度恢复，但7 d移植组在损伤后14、21、28、35、42 d的恢复效果优于其他2组，见表1。

表1 SCI后不同时间点各组大鼠BBB评分情况（分，）

表1 SCI后不同时间点各组大鼠BBB评分情况（分，）

注：与对照组比较，①P＜0.05；与24 h移植组比较，②P＜0.05

组别 只数 S C I前 7 d 1 4 d对照组 8 0 . 7 5 ± 0 . 1 2 1 . 0 6 ± 0 . 4 1 3 . 1 8 ± 0 . 5 3 2 4 h移植组 8 0 . 7 3 ± 0 . 1 1 1 . 6 2 ± 0 . 4 4 3 . 5 0 ± 0 . 3 7 7 d移植组 8 0 . 7 6 ± 0 . 1 4 1 . 8 9 ± 0 . 2 5① 5 . 2 5 ± 0 . 5 3①②组别 2 1 d 2 8 d 3 5 d 4 2 d对照组 4 . 9 3 ± 0 . 5 6 6 . 7 5 ± 0 . 5 0 7 . 5 0 ± 0 . 8 4 7 . 9 0 ± 0 . 8 2 2 4 h移植组 5 . 3 1 ± 0 . 2 5 7 . 3 7 ± 0 . 5 1 8 . 0 0 ± 0 . 4 6 8 . 3 1 ± 0 . 4 5 7 d移植组 8 . 3 1 ± 0 . 4 5①②1 0 . 6 2 ± 0 . 6 9①② 1 1 . 6 2 ± 0 . 8 3①② 1 2 . 2 5 ± 0 . 8 0①②

2.5 HE染色结果观察

SCI后42 d，所有大鼠均未发现肿瘤形成及免疫排斥反应。对照组和24 h移植组SCI处可见大量炎性细胞和胶质细胞浸润和结缔组织增生，及较大的空白囊腔；7 d移植组SCI处再生的神经纤维填补在损伤处，可见较小的脊髓空洞，少量的胶质疤痕组织，见图4。

图4 7 d移植组SCI后42 d损伤部位免疫荧光检测（×40）

3 讨论

目前BMSCs的体外分离、培养没有统一的标准方法，主要有差速贴壁法、密度梯度离心法、流式细胞仪分离法、免疫磁珠分离法[5]。细胞培养、传代需消耗大量的培养液及人力，且易导致细胞污染。细胞冻存技术是将细胞置于液氮中低温保存而保持其生物学特性，当实验需要时进行细胞复苏。在细胞冻存过程中，使用二甲基亚砜防止细胞损伤。细胞复苏时须在1～2 min内快速解冻，以免影响细胞活性。本实验中冻存的BMSCs复苏后[2]，细胞的形态及生物学特性无明显改变，获得了大量细胞，满足了实验需求。

理想的SCI模型应具有临床相似性和可重复性。本实验选用的是美国卫生研究所在1993年资助的MASCIS撞击仪，统一设定10 g的撞击棒从25 mm高度坠落致伤T10脊髓，该仪器能准确记录撞击的轨迹，减少人工误差，制备统一的SCI模型，保证实验的科学性[6]。

目前细胞移植方面，BMSCs移植途径有多种，包括局部直接注射、静脉注射、蛛网膜下腔注射[7,8]等。局部直接注射到达SCI区BMSCs较多，但是易对SCI处造成二次机械性损伤；蛛网膜下腔移植的难度较大。一般情况下，血脊髓屏障阻碍大部分细胞进入脊髓，血脊髓屏障受到破坏后，经静脉注射的BMSCs能通过血脊髓屏障，并在宿主脊髓内存活[9,10]。本实验采用静脉移植方式，操作简便，创伤较小，经尾静脉注射的Brdu标记的BMSCs经免疫组化检测证实出现在损伤脊髓处。

SCI包括原发性机械损伤和继发性二次损伤。继发性损伤机制包括脊髓脉管系统毁坏和局部缺血、谷氨酰胺兴奋性中毒、脂质过氧化反应和炎症反应[11,12]，这些机制单独或一起引起细胞凋亡。SCI部位的神经细胞直接受损，而反应性巨噬细胞、中性粒细胞和淋巴细胞的激活，诱导损伤部位及周围神经元的二次损伤，导致空腔和疤痕形成[13]。在先前的细胞移植研究发现，SCI早期移植细胞的生存率低于延期移植组[14]。本实验结果显示，在BMSCs移植大鼠的损伤脊髓中心均能发现阳性细胞，而7 d移植组损伤区的细胞多于24 h移植组，和先前的研究相符。本实验选用BBB 21分评分法[15]对大鼠的后肢运动功能进行评定，有较高的准确性，操作简单。所有大鼠SCI前BBB评分为21分，SCI造模后双下肢完全瘫痪，BBB评分为0分。损伤后第7天，各组大鼠的后肢关节都有轻微的运动；14～42 d，7 d移植组的评分显著高于相应时间点的其他各组，说明在损伤后7 d静脉移植BMSCs可促进损伤脊髓的恢复，笔者认为这可能和SCI后的病理变化有关。SCI后，神经细胞坏死、组织水肿、凝血功能异常等因素导致脊髓大片坏死。炎性细胞浸润、氧自由基增加进一步加重SCI，不利于细胞存活。所以SCI后7 d进行细胞移植对神经功能恢复的效果更佳。SCI后42 d，损伤脊髓处HE染色显示未见肿瘤形成，损伤区域细胞变性、坏死，有较多的淋巴细胞及吞噬细胞聚集，且有脊髓空洞形成，损伤区域周围可见胶质细胞增生和炎性细胞的浸润。7 d移植组大鼠脊髓结构的组织空洞较小，炎性细胞的浸润减少，说明BMSCs移植有助于损伤脊髓的组织结构恢复。

综上所述，本实验证明BMSCs可通过静脉移植的方式迁移到SCI部位，并可促进SCI大鼠运动功能的恢复，且SCI后7 d是静脉移植治疗的适宜时间。

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（本文编辑：王晶）

Therapeutic Effect of Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells on Spinal Cord Injury Rats

JIANG Xian-feng,TANG Feng-wu,CHEN Xu-yi,ZHANG Shai.1.Department of Neurosurgery,Affiliated Hospital of the Armed Police College,Tianjin 300162,China；2.Tianjin Medical School,Tianjin 300162,China

Objective:To study the effect of rat bone marrow mesenchymal stem cells(BMSCs)on rats with spinal cord injury (SCI)at different time points.Methods:SCI models were established in 24 SD rats,and randomly divided into 3 groups of 8 rats in each:control group was injected with normal saline after SCI,groups 24 h transplantation and 7 d transplantation were injected BMSCs buffer(2×106/mL)1 mL respectively at 24 h,7 d after SCI through the tail vein.Basso,Beattie and Bresnahan(BBB)locomotor rating scale was used at different time points following damage.Rats were sacrificed at day 42,and cavition in the contused spinal cord were observe by HE staning.Results:The BBB scores of the 7 d transplantation group were better than those of the 24 h transplantation group and the control group at day 14,21,28,35,42 (P＜0.05).HE staining showed that there were cavition in the contused spinal cord of 3 groups,and the cavition of the 7 d transplantation group was significantly less than the groups 24 h transplantation and control.Conclusion:BMSCs can be cultured and amplificatedin vitro,can be injected through the tail vein to migrate to the SCI site,to promote the recovery of neurological function in SCI rats. And the best time is about 7 d after the injury.

bone marrow stromal cells;spinal cord injuries;cell transplantation

R741;R741.05;R744

A DOI 10.16780/j.cnki.sjssgncj.2016.02.002

1.武警后勤学院附属医院神经外科天津300162

2.天津医科大学天津300162

国家自然科学基金（No.11102235）

2015-08-10

张赛zhangsai718@vip. 126.com