PD—ECGF在CEA术后再狭窄血管中的表达及其与管腔狭窄程度的相关性研究

徐敬轩　栾新平

【摘要】 目的 探讨血小板衍生内皮细胞生长因子（PD-ECGF）在颈动脉粥样硬化剥脱术（carotid endarterectomy， CEA）术后再狭窄血管中的表达及其与管腔狭窄程度的相关性。方法 20只新西兰清洁级白兔， 随机分为对照组（5只）和实验组（15只）， 建立兔颈动脉再狭窄模型， 取材后行免疫组织化学染色， 与对照组相比， 观察实验组PD-ECGF的表达， 并观察其阳性表达强度与管腔狭窄程度的关系。结果 实验组PD-ECGF阳性表达（>2分）13例， 阴性（≤2分）2例， 对照组阳性表达3例， 阴性12例， 对比差异有统计学意义（P<0.01）；PD-ECGF阳性表达强， 其管腔狭窄程度较轻， 表达较弱时则相反。结论 PD-ECGF可能是血管再狭窄形成诸多因素中的一种起保护作用的因子， 可促进内皮细胞的迁移， 从而抑制血管平滑肌的增殖。

【关键词】 血小板衍生内皮细胞生长因子；颈动脉粥样硬化剥脱术；再狭窄血管

CEA是预防和治疗缺血性脑卒中的主要手术方式， 但术后仍有再狭窄的发生， 周定标[1]报道发生率为1%～31%， 如何有效的预防已成为困扰临床医生的一大难题。PD-ECGF是血小板中发现的一种内皮细胞生长因子， 本研究通过对20只新西兰白兔进行分组实验， 从而探讨该因子在CEA术后再狭窄血管中的表达及其与管腔狭窄程度的相关性， 现报告如下。

1 材料与方法

1. 1 材料 新西兰清洁级白兔20只， 随机分为对照组（5只）和实验组（15只）。其中对照组给予正常喂养6周后取材， 每只在颈动脉不同部位取3份， 共15份标本作为对照；实验组给予高脂喂养2周， 形成斑块后行CEA术， 术后继续高脂喂养4周， 待再狭窄形成后取材。

1. 2 仪器与试剂 手术显微镜及显微器械， 爱惜康可吸收缝线， LipofectamineTM2000；地高辛精（Dig-11-ddUTP）；PD-ECGF单克隆抗体；携带PD-ECGF质粒的克隆；大肠杆菌DH5a；分子克隆工具酶；琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒；质粒抽提试剂盒；SP试剂盒；分析醇。

1. 3 方法 ①实验组颈动脉再狭窄模型建立方法：给予1 g胆固醇/（d·只）， 喂养2周。用3%戊巴比妥钠3 mg/kg， 耳缘静脉麻醉。颈部剃毛， 于甲状软骨下1 cm处， 沿颈白线切开皮肤约4 cm， 用显微剥离子在动脉壁中膜层分离， 完整切除已分离的内膜， 用缝合线连续缝合动脉切口， 缝合后动脉直径应不低于原血管直径的85%， 用不含肝素的生理盐水充盈管腔， 放开血管夹， 检查无明显出血后， 将颈总动脉放回原位， 缝合颈阔肌和颈部皮肤切口。生存动物术后继续给予高胆固醇喂养4周。②血管标本的制备：术后实验组高脂喂养4周， 麻醉试验动物后在无菌条件下锐性切下狭窄处血管约1.5 cm， 置冰上用肝素盐水冲洗管腔内血液， 4%多聚甲醛固定。③原位杂交组织化学染色检测PD-ECGF的阳性表达：用Dig-11-ddUTP修饰合成好的寡核苷酸探针并纯化。将各组石蜡包理切片浸入二甲苯10 rain移除石蜡， 用30 ?l 0.4 ng/?l的PD-ECGF mRNA的寡核苷酸探针液加在切片上， 过夜；滴加酶标地高辛抗体（1：500）， 37℃30 min；加显色液后显色；二甲苯透明， DPX封固。④病理学检查：取血管组织0.25 cm， 将其连续切片， 厚度为0.4 ?m， 行苏木素-伊红（HE）染色， 计算机病理图像分析系统下观察管腔狭窄率=（1-现存管腔面积/内弹力膜以下面积）×100%。根据NASCET狭窄程度分级：轻度<30%， 中度30～69%， 重度70～99%。

1. 4 判定标准 显微镜下观察， 阳性信号为紫蓝色颗粒状沉淀物分布于细胞浆中， 计数显微高倍视野中阳性表达， 强度评分标准：无染色记0分；轻度染色记1分；中度染色记2分；强染色记3分。细胞比例评分标准：无染色记0分；<25%染色记1分；25%～50%染色记2分；>50%染色记3分。评分之和>2分， 则为PD-ECGF表达阳性， ≤2分则为阴性。

1. 5 统计学方法 采用SPSS16.0统计学软件进行数据统计分析。计数资料以率（%）表示， 采用χ2检验。P<0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

实验组无染色1例， 轻度染色1例， 中度染色2例， 强染色11例；细胞比例：无染色1例， <25% 4例， 25%～50% 2例， >50% 8例。对照组无染色13例， 轻度染色1例， 中度染色1例， 无强染色；细胞比例：无染色13例；<25%2例；无>25%染色。实验组阳性表达（>2分）13例， 阴性（≤2分） 2例； 对照组阳性表达3例， 阴性12例， 比较差异有统计学意义（χ2=13.39， P<0.01）。对实验组管腔狭窄程度观察结果表明， PD-ECGF阳性表达强， 其管腔狭窄程度较轻， 表达较弱时则相反。

3 讨论

PD-ECGF在血管生成领域中已被业界学者关注。目前血小板中已知的生长因子如PDGF， 表面生长因子（EGF）等， 均未发现具有促进内皮生长作用， 而PD-ECGF因其释放条件不同， 是血小板中目前发现唯一的内皮细胞生长因子[2]， 在体内血管生成中起着重要作用。

CEA术后造成管腔再狭窄的原因是术后内膜斑块被切除， 内皮细胞缺失， 启动了血栓形成、炎症反应、平滑肌细胞增殖和迁移等过程， 导致再狭窄的发生。其中心环节是血管平滑肌的过度增殖， 有学者通过体外实验已证实PD-ECGF具有刺激和增强内皮细胞迁移特性， 进而修复损伤、 维持血管稳定[3]。国外肿瘤研究的相关文献已证实， PD-ECGF可促进肿瘤血管内皮细胞迁移， 而并未加重其对周围的浸润[4]。国内也有学者证实， PD-ECGF能增强内皮细胞和平滑肌细胞的迁移， 从而抑制平滑肌细胞的过度增殖[3]。

作者在前期工作中， 对颈动脉粥样硬化斑块形成的血管中PD-ECGF的表达进行观察和对比， 已初步证实PD-ECGF在颈动脉粥样硬化斑块形成的血管中呈阳性表达， 但在CEA术后再狭窄形成的血管中如何， 尚未查阅到相关报道。本研究通过建立新西兰兔颈动脉CEA术后再狭窄动物模型， 与对照组进行对比， 观察再狭窄形成的血管中PD-ECGF的阳性表达情况， 同时结合病理， 进行再狭窄程度的观察。研究结果显示，PD-ECGF在再狭窄形成的血管中有阳性表达， 在其形成的过程中发挥一定的作用。而通过与病理检查所示狭窄程度的观察发现， 阳性细胞数百分数越低者， 血管管腔狭窄程度越严重， 而阳性细胞数百分数越高者， 管腔反而轻度狭窄， 说明PD-ECGF可能是血管再狭窄形成诸多因素中的一种起保护作用的因子， 可促进内皮细胞的迁移， 从而抑制血管平滑肌的增殖。

总之， PD-ECGF可能抑制CEA术后血管再狭窄形成， 为开展基因转染技术研究提供理论依据及实验基础， 因本研究样本量有限， 尚缺乏说服力， 将在随后开展的寡核苷酸转染研究中进一步证实。

参考文献

[1] 周定标.颈动脉内膜切除术.北京：人民军医出版社， 2005： 276-280.

[2] 李冰， 尚涛.血小板衍生内皮细胞生长因子的研究进展.国际妇产科学杂志， 2008， 35（2）：86-88.

[3] 朱晋坤， 毛华， 尹扬光， 等.血小板源性生长因子和血小板源性内皮细胞生长因子在内皮细胞和血管平滑肌细胞中的作用研究.中国全科医学， 2015， 9（9）：1023-1028.

[4] Bijnsdorp IV， Capriotti F， Kruyt FA， et al. Thymidine phosphorylase in cancer cells stimulates human endothelial cell migration and invasion by the secretion of angiogenic factors. Br J Cancer， 2011， 104（7）：1185-1192.

[收稿日期：2015-12-07]