树突细胞及其相关趋化因子受体在慢性阻塞性肺疾病大鼠肺部的表达变化及其意义

孙得胜，欧阳瑶，顾延会

563003贵州省遵义市，遵义医学院附属医院呼吸一科(孙得胜，欧阳瑶，顾延会)；华中科技大学同济医学院附属同济医院呼吸与危重症医学科(孙得胜)



·论著·

树突细胞及其相关趋化因子受体在慢性阻塞性肺疾病大鼠肺部的表达变化及其意义

孙得胜，欧阳瑶，顾延会

563003贵州省遵义市，遵义医学院附属医院呼吸一科(孙得胜，欧阳瑶，顾延会)；华中科技大学同济医学院附属同济医院呼吸与危重症医学科(孙得胜)

【摘要】目的 了解树突细胞(DC)及其趋化因子受体CCR6、CCR7在慢性阻塞性肺疾病(COPD)大鼠肺部的表达变化，并探讨其意义。方法选用20只清洁级健康Wistar大鼠，采用随机数字表法分为健康对照组(10只)和COPD组(10只)。COPD组使用香烟烟雾刺激和气道内注入脂多糖(LPS)的方法制备COPD模型。第29天取大鼠肺组织，制作病理切片，行HE染色观察其病理学改变；采用免疫组织化学技术检测肺部DC的表达水平，酶联免疫吸附试验(ELISA)法检测支气管肺泡灌洗液(BALF)中CCR6和CCR7的表达水平。结果COPD组大鼠肺组织HE染色符合COPD典型病理表现，OX(62)和CD(83)的阳性染色均主要表达于细胞的胞质，呈棕黄色。COPD组DC表达水平高于健康对照组，DC表达水平低于健康对照组，差异均有统计学意义(P<0.01)。COPD组BALF中CCR6表达水平高于健康对照组，CCR7表达水平低于健康对照组，差异均有统计学意义(P<0.01)。结论DC及其趋化因子受体CCR6在COPD大鼠肺部增多，而成熟DC及其趋化因子受体CCR7在COPD大鼠肺部减少。

【关键词】肺疾病，慢性阻塞性；树突细胞；受体，CCR6；受体，CCR7

孙得胜，欧阳瑶，顾延会.树突细胞及其相关趋化因子受体在慢性阻塞性肺疾病大鼠肺部的表达变化及其意义[J].中国全科医学，2016，19(11)：1301-1304.[www.chinagp.net]

Sun DS，Ouyang Y，Gu YH.Changes of the expressions of dendritic cells and related chemokine receptors in the lungs of rats with COPD and its significance[J].Chinese General Practice，2016，19(11)：1301-1304.

慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease，COPD)，气道和肺组织对有害气体或颗粒的异常炎性反应是其重要特征[1]。这种炎症的产生机制尚不明确，但有学者发现在COPD的发病过程中有免疫细胞被募集到肺[2]。COPD的免疫应答是在特定的抗原驱使下完成的[2-3]，同时其受到树突细胞(dendritic cell，DC)的严密调控[4-5]。DC环绕气道形成敏感的防御体系，在外来抗原侵袭机体时，其能从完好的上皮组织移行到受侵袭的部位并摄取这些抗原[6]，DC表面受体在信号刺激下介导了此过程[7]。DC继续迁移到局部引流淋巴结，提呈所摄取的抗原给相关的T淋巴细胞。相应的炎性反应就是在这些T淋巴细胞的介导下发生的。DC的迁移是趋化作用的结果，在趋化因子受体与相关的趋化因子间的相互作用下完成[8]。

1材料与方法

1.1实验材料标准实验用清洁级Wistar大鼠(共20只，雄性)，由第三军医大学实验动物中心提供。二步法抗兔/鼠通用型免疫组化试剂盒(上海基因科技公司)，小鼠抗大鼠OX62单克隆抗体(R&D Systems公司)，兔抗-CD83多克隆抗体(北京博奥森生物技术公司)，大鼠CCR6、CCR7酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒(上海西唐生物科技公司)，羊抗鼠IgG-HRP(北京爱普华美生物科技公司)，LPS(Sigma公司)，香烟(遵义牌，烟气烟碱量1.2 mg，焦油含量13 mg，烟气一氧化碳量14 mg，贵州中烟工业有限责任公司)。

1.2模型制备20只大鼠采用随机数字表法分为：健康对照组(10只)、COPD组(10只)。使用香烟烟雾刺激和气道内注入LPS的方法制备COPD模型[9]：COPD组大鼠于第1天和第15天气道内注入LPS溶液(200 μg/200 μl)；第2～28天(第15天除外)于造模箱(由玻璃制成，25 cm×35 cm×80 cm，箱顶有直径约2 cm的通气孔，箱中部从下向上有两排铁网，铁网间摆放并点燃香烟)内被动吸烟(2次/d，香烟12支/次)。当日2次被动吸烟造模间隔2 h，健康对照组不予上述处理。COPD组大鼠注射LPS日呼吸新鲜空气，不给予上述烟雾刺激处理。

1.3标本采集第29天分别选取两组大鼠麻醉后开胸，结扎右肺，剪取右肺下叶予多聚甲醛溶液固定，制作石蜡标本及病理切片，并行HE染色及免疫组织化学实验。取右肺上叶放入低温冷冻管，并置于液氮中保存备用。在大鼠气管下段做一倒“T”形切口，插入内径约1 mm塑料管，用注射器缓慢注入4 ℃ 0.9%氯化钠溶液5 ml，并轻柔按摩大鼠肺脏行支气管肺泡灌洗3次，将回抽的灌洗液保存，用于ELISA检查。

1.4指标检测镜下观察COPD组HE染色的切片是否有COPD特征性病理改变表现，如气道壁出现以中性粒细胞、淋巴细胞为主的炎性细胞浸润以及肺泡壁变薄、肺泡腔扩大、破裂或形成大疱等改变。免疫组织化学实验使用两步法，分别用小鼠抗大鼠OX62(即CD103，下同)单克隆抗体和兔抗-CD83多克隆抗体作为一抗，稀释浓度为1∶100，按试剂盒中的产品说明书的要求进行操作。用PBS替代一抗作为阴性对照。光镜下每张切片在阳性表达较高区随机选取5个高倍视野(×400)，采图后输入软件IPWIN 60中分析，计算积分光密度(IOD)的平均值代表样本中OX62或CD83的表达强度，实验重复4次。BALF中CCR6和CCR7表达水平的测定采用ELISA法，实验重复4次。

2结果

2.1两组大鼠肺组织的病理表现对照组：肺泡结构完整连续，肺泡壁完好，小支气管未见炎性细胞浸润及腺体(见图1，本文彩图详见本刊官网www.chinagp.net电子期刊相应文章附件)。COPD组：部分肺泡间隔增宽，在增宽的肺泡间隔内可看到毛细血管扩张充血，并伴有淋巴细胞、中性粒细胞等炎性细胞浸润；部分肺泡间隔出现变窄、断裂或形成大疱(见图2)，符合COPD的特征性病理表现特点。

图1　对照组第29天肺组织病理(HE染色，×100)

图2　COPD组第29天肺组织病理(HE染色，×100)

图3　OX62表达于胞质(免疫组织化学染色，×100)

图4　CD83表达于胞质(免疫组织化学染色，×400)

图5　以PBS代替一抗的阴性对照(免疫组织化学染色，×400)

组别只数积分光密度(IOD)OX62 CD83健康对照组1017.1±3.343.4±14.3COPD组1073.4±5.414.8±5.6t值33.006.37P值<0.01<0.01

注：COPD=慢性阻塞性肺疾病

2.3两组大鼠BALF中CCR6和CCR7表达水平比较COPD组BALF中CCR6表达水平高于健康对照组，CCR7表达水平低于健康对照组，差异均有统计学意义(P<0.01，见表2)。

Table2ComparisonoftheexpressionlevelsofCCR6andCCR7inBALFofratsbetweenthetwogroups

组别只数CCR6CCR7健康对照组10 43.6±5.5 41.7±7.4COPD组10105.8±2.710.4±3.1t值33.1516.08P值<0.01<0.01

3讨论

COPD是以不完全可逆、呈进行性发展的气流受限为特征的气道慢性炎性疾病[9]，吸烟和感染被公认为COPD发病的两个最主要的环境因素。本研究使大鼠被动吸烟并向其气道注入LPS以模拟这一病理过程，28 d后COPD组病理改变结果与文献报道一致[10]，且符合COPD病理的特征性表现。

国际上多项研究在COPD患者中发现了DC的数量和功能均发生了改变，这些发现提示其可能与COPD的发病机制有关。但这些试验所得到的结果并不相同。有研究发现在慢性香烟烟雾刺激下，小鼠肺部DC的数量明显下降[11]。但也有研究发现COPD患者气道中DC数量比吸烟无COPD者以及不吸烟者明显增多[12]。

近年来，DC的成熟程度以及未成熟DC(immature DC，iDC)与成熟DC(mature DC，mDC)在疾病不同阶段的不同作用备受关注。机体的DC源于骨髓，随血流到达全身，成为具有摄取、处理抗原能力的iDC。当外界抗原入侵时，iDC摄取入侵的抗原，并将其消化降解成含抗原决定簇的肽链，与细胞表面的主要组织相容性复合体(MHC)结合，这些携带抗原-MHC复合物的DC游走至支气管肺泡周围的引流淋巴结，把抗原提呈给淋巴结中的T淋巴细胞[8]。在携带抗原的DC向引流淋巴结迁移的过程中，DC逐渐成熟，成熟过程中捕获抗原的能力逐渐下降，提呈抗原的能力逐渐增强。

综上所述，不同成熟度DC在COPD的发病中扮演不同的角色，本研究提示COPD组大鼠部分iDC可能在CCR6的作用下，被趋化到肺部，引起肺部DC的增多。同时，COPD大鼠肺脏局部mDC及其趋化因子受体CCR7减少，但其具体的作用机制尚需要进一步地深入研究。

本文的主要内容：

本文检测了不同成熟度的树突细胞及其相关趋化因子受体在慢性阻塞性肺疾病大鼠肺部的表达水平，发现未成熟树突细胞及其趋化因子受体明显增多，而成熟树突细胞及其趋化因子受体显著减少。这对于明确慢性阻塞性肺疾病的发病机制有一定的指导意义。

作者贡献：孙得胜、欧阳瑶进行课题设计与实施、资料收集整理、撰写论文、成文并对文章负责；孙得胜、顾延会进行课题实施、评估、资料收集；欧阳瑶进行质量控制及审校。

本文无利益冲突。

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(本文编辑：贾萌萌)

Changes of the Expressions of Dendritic Cells and Related Chemokine Receptors in the Lungs of Rats With COPD and Its Significance

SUNDe-sheng，OUYANGYao，GUYan-hui.

DepartmentofRespiratoryMedicine，AffiliatedHospitalofZunyiMedicalCollege，Zunyi563003，China

【Abstract】ObjectiveTo investigate the changes of the expressions of dendritic cells and related chemokine receptors CCR6 and CCR7 in the lungs of rats with COPD and its significance.MethodsTwenty clean healthy Wistar rats were selected and divided into health control group(n=10)and COPD group(n=10)using random number table method.In COPD group，COPD models were induced by cigarette smoke exposure and intratracheal injection of LPS.On the 29th day，the lung tissues of rats were obtained to make pathological sections.We observed the pathological changes of their lungs by HE staining，assayed the contents of CCR6 and CCR7 in the BALF by ELISA and evaluated the expression levels of DC and DC in their lungs by immunohistochemistry.ResultsThe HE staining results of the COPD models were consistent with the typical pathological features of COPD patients.The positive staining of OX(62) and CD(83) was mainly manifested as cytoplasm being the color of claybank.COPD group was higher in the expression levels of DC and was lower in the expression level of DC than health control group(P<0.01).COPD group was higher in the content of CCR6 in BALF and was lower in the content of CCR7 than health control group(P<0.01).ConclusionDCs and CCR6 increase but mature DCs and CCR7 decrease in COPD rat lungs.

【Key words】Pulmonary disease，chronic obstructive；Dendritic cells；Receptors，CCR6；Receptors，CCR7

(收稿日期：2015-11-16；修回日期：2016-01-10)

【中图分类号】R 563.9

【文献标识码】A

doi：10.3969/j.issn.1007-9572.2016.11.015

通信作者：欧阳瑶，563003贵州省遵义市，遵义医学院附属医院呼吸一科；E-mail：ouyangyao116@sohu.com

基金项目：国家自然科学基金资助项目(81460008)