高效液相色谱法测定婴幼儿食品和乳品中叶黄素

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（东北农业大学国家乳制品质量监督检验中心，哈尔滨150028）

高效液相色谱法测定婴幼儿食品和乳品中叶黄素

张丽宏,宋戈,亢美娟

（东北农业大学国家乳制品质量监督检验中心，哈尔滨150028）

建立了高效液相色谱法测定婴幼儿食品和乳品中叶黄素的方法。样品通过70℃皂化10m in，释放出叶黄素，正己烷萃取，浓缩后甲醇溶解定容，以甲醇为流动相，经C18色谱柱分离，用紫外检测器于445 nm波长处检测。回收率在96.0%～102.0%，精密度(RSD)为1.95%～3.78%，检出限分别为0.02μg/g。该方法操作简单，精密度好，准确性高，经济环保。

叶黄素；婴幼儿食品；乳品；高效液相色谱

0 引 言

叶黄素属于胡萝卜醇一类的色素，具有重要的生理活性，有抗氧化、抗衰老等功能，另外对视网膜中的黄斑有重要保护作用。由于叶黄素人体不能自身合成，只能从食物中摄取，国内外出现了添加叶黄素的强化食品。近几年，国内外对叶黄素检测研究的文献有很多[1-6]，但都不适用婴幼儿食品和乳品中叶黄素的测定。奶粉中叶黄素检测的国家标准[7]和有关文献报道的方法[8-9]中样品前处理中采用直接提取，而在实际样品中添加的叶黄素原料经微囊化处理，不易直接提取，而且所用萃取剂容易把其他胡萝卜醇类物质提取出来给测定带来干扰。

本研究通过优化的皂化条件把样品中的叶黄素完全游离释放，用合理的萃取剂进行提取，建立婴幼儿食品和乳品中叶黄素的检测方法，准确简单。

1 实 验

1.1 仪器设备

Waters1525高效液相色谱仪配Waters2487紫外检测器；氮吹仪；Q L-901型振荡器。

1.2 色谱条件

叶黄素标准溶液：称取叶黄素标准物质10.0mg,用无水乙醇定容至10m L容量瓶中,摇匀，配成1.000 g·L-1标准贮备溶液，储藏于-40℃，使用时按需要制成相应的标准工作液；甲醇为色谱纯；正己烷；无水乙醇；氢氧化钾；抗坏血酸；实验用水均为蒸馏水；以上试剂除标注的外均为分析纯。

1.3 方法

1.3.1 色谱条件

色谱柱：Inertsil ODS-3柱（250 mm×4.6mm，5 m），柱温为30℃；检测器为紫外检测器；测定波长为445 nm；流动相为甲醇；流速为1.0m L/m in。

1.3.2 样品处理

调味奶、酸奶和乳饮料：直接吸取1 m L,雪糕、冰激淋：融化后吸取1 m L，移入10 m L带螺旋盖的试管称量；果泥、果酱和婴幼儿配方乳粉：称取0.1 g,移入10 m L带螺旋盖的试管，加入30℃左右水1 m L振荡溶解；面包和婴幼儿配方米粉：称取2 g移入三角瓶中，加入0.2 g淀粉酶和30℃左右水20 m L,充氮密封后37℃酶解30 m in，吸取1 m L移入10 m L带螺旋盖的试管。然后向样品中加入约0.1 g抗坏血酸和1m L无水乙醇，混匀，再加入0.5 m L 50%氢氧化钾水溶液,在70℃水浴中皂化10 m in，凉水冷却后加入正己烷3 m L，用振荡器振荡萃取1 m in，萃取3次，合并萃取液，在40℃下用氮吹仪吹干，加入1 m L甲醇定容，振荡完全溶解残留物，在-18℃冷冻30 m in，0.45μm滤膜过滤,供分析测定。

2 结果与分析

2.1 皂化条件的选择

检测结果的准确性与前处理的好坏直接相关，而在本试验中前处理的好坏关键在于皂化条件选择的是否合理。好的皂化条件应该满足既能把被测物完全从样品中释放出来，又能保证被测物被破坏的风险最低，损失最小。选择同一个均匀的样品，进行平行实验。皂化时都加入0.5 m L质量分数为50%氢氧化钾溶液和皂化10 m in，在不同温度下皂化，得到皂化温度与测定结果的关系图如图1(a)，可以确定70℃是最佳皂化温度。在同一皂化温度70℃下，都加入0.5 m L质量分数为50%氢氧化钾溶液后，皂化不同的时间，得到皂化时间与测定结果的关系图如图1（b）,可以确定在70℃皂化温度下，皂化10 m in最佳。在同一皂化温度70℃下，皂化相同的时间10 m in，加入不同量的碱，得到加入碱的量与测定结果的关系图如图1（c）,可以确定在70℃皂化温度下，皂化10 m in时，加入碱的量为0.5 m L 50%氢氧化钾溶液时最佳。在皂化温度低、皂化时间短或加入碱的量少时皂化不完全，被测物不能全部从样品中游离出来，而皂化温度过高、皂化时间过长或加入碱的量过多被测物就会被氧化，损失了。另外通过实验对比皂化样品和不造皂化样品两种前处理，对添加游离叶黄素醇的样品，检测结果没有区别，但对添加经微囊化处理的叶黄素醇酯类的样品，经过皂化前处理的检测结果更接近添加的理论值。故最终选择加入0.5 m L 50%氢氧化钾溶液，70℃皂化温度，皂化10m in的皂化条件。

图1 皂化温度、皂化时间和碱的添加量对测定结果的影响

2.2 萃取剂的选择

被测物完全从样品中释放出来后，选择一种恰当的溶剂把被测物全部提取出来才能保证检测结果准确可靠。选取3种提取溶剂正己烷、石油醚、乙醚，对同一个均匀样品进行萃取。用正己烷作为萃取剂时，分层效果好，浓缩吹干定容后，残留物能容易全部溶解，检测结果也最高；其他的提取溶剂在萃取时不易分层，把其他脂溶性维生素也提取出来了，浓缩吹干定容后，有残留物不溶解。而能溶解叶黄素的氯仿和乙醇，沸点高不适合作提取溶剂，故确定正己烷为萃取剂。

2.3 色谱条件的选择

要保证检测结果的准确性，好的分离条件也必不可少。与反相C18柱相比，C30柱有更好的分离能力，对分离类胡萝卜素具有明显的优势，但价格是C18柱的3到4倍，而且在分离被测物时要用到甲基叔丁基醚，气味大，对环境和人都有毒害。样品经过皂化，正己烷萃取后，得到的分析液杂质少，除叶黄素外其他类胡萝卜素没有被提取出来，干扰小，标准样品、样品和空白样品色谱图如图2～图4所示。用反相C18柱，甲醇作流动相，进行分离完全能达到分析要求。

2.4 标准曲线和检出限

分别配制质量浓度为0.001，0.005，0.05，0.1，1.0，10.0，20.0，50.0m g/L的叶黄素标准溶液，在最佳色谱条件下，进行了标准曲线的测定，得到叶黄素回归方程及线性相关系数、线性范围，并以3倍信噪比时的进样浓度计算出了检出限如表1所示。

图2 标准溶液的色谱

图3 样品的色谱

图4 空白样品的色谱

表1 标准曲线、相关系数以及线性范围和检出限

2.5 回收率和精密度

以同一个空白样品为实验材料，加入一定量的叶黄素标准溶液,进行加标实验，平行测定8次，得出精密度并以平均测定值计算回收率，结果如表2所示。

表2 叶黄素回收率和精密度（n=8）

由此可见，测定结果的较为稳定，方法的重复性较好。

2.6 样品测定

按试验方法对样品进行测定，结果如表3所示。

表3 样品测定结果

3 结 论

本文重点研究了皂化条件及萃取剂对分析测定的影响，建立了高效液相色谱法测定婴儿配方食品和乳品中叶黄素的方法。该方法测定结果重现性好，准确度高，简单易操作，经济环保，适合用于叶黄素的日常检测。

[1]石晋,栾雨时,王静云,等.HP LC法测定甘薯叶片中的叶黄素[J].植物研究,2008,28(6):767-769.

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[6]DOMENICO MONTESANO，ORIELLA GENNARIM，SERENELLA SECCIAM，STEFANIA ALBRIZIO.A Simple and Selective Analytical Procedure for the Extraction and Quantification of Lutein from Tomato By-Products by HPLC-DAD[J].Food Anal，Methods, 2012,5:710-715.

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[9]高迎春,尹伶灵,陈玲,等.高效液相色谱法测定乳制品中的叶黄素[J].中国乳品工业,2012,40(4):48-50.

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Determination of lutein in foods for infants and dairy products by high-performance liquid chromatographic

ZHANG Li-hong,SONG Ge,KANG Mei-juan
(National Dairy Testing Center,Northeast Agriculture University,Harbin 150028,China)

A simple and rapid method for determination of lutein in foods for infants and dairy products by high-performance liquid chromatography(HPLC)was developed.Following a mild saponi cation procedure(70℃for 10min)demonstrated to be benign to lutein,lipophilic components were partitioned by a single extraction into hexane and concentrated in mobile phase.Separation of lutein was achieved using a C18 column and isocratic elution with methanol and detected at445 nm with a ultraviolet detector.The recovery were 96.0%～102.0%,the relative standard deviations(RSD)were 1.95%～3.78%,the minimum detectable values were 0.02μg/g.This method can be used for the routine analysis of lutein.

lutein;foods for infants;dairy products;HPLC

TS252.7

：A

：1001-2230（2016）02-0047-03

2015-09-15

张丽宏（1975-），女，工程师，从事乳制品检测与研究。