肠膜明串珠菌及其近缘种dnaA和rpoB基因的系统发育分析

（内蒙古农业大学乳品生物技术与工程教育部重点实验室，呼和浩特010018）

肠膜明串珠菌及其近缘种dnaA和rpoB基因的系统发育分析

冯淑贞，徐海燕，宋宇琴，张和平，孙志宏

（内蒙古农业大学乳品生物技术与工程教育部重点实验室，呼和浩特010018）

比较16S rRNA基因、dnaA、rpoB部分基因序列对Leuconostoc mesenteroides（Leu.mesenteroides）及其近缘种的分辨力，为肠膜明串珠菌提供快速准确的鉴定方法。以分离自自然发酵乳制品中的8株Leu.mesenteroides为研究对象，以其看家基因dnaA、rpoB部分基因序列作为分子标记，结合GeneBank数据库中的近缘种及亚种的相应序列构建系统发育树，并与16S rRNA基因的系统发育树进行比较。研究发现，基于Leu.mesenteroides及其近缘种的dnaA和rpoB部分基因序列构建的系统发育树的拓扑结构与16S rRNA基因基本一致，但分辨率高于16S rRNA基因；种间的dnaA和rpoB部分基因序列相似性分别为81.7～84.8%和85.5、87.4%，而种间16S rRNA基因相似性为98.1%～99.5%。相较于16S rRNA基因，dnaA和rpoB基因更容易鉴定肠膜明串珠菌及其近缘种，其中rpoB可明晰区分试验菌株与肠膜明串珠菌亚种间的系统发育关系，因此rpoB基因可作为16S rRNA基因的辅助工具用于Leu.mesenteroides及其近缘种的快速鉴定。

肠膜明串珠菌；系统发育分析；16S rRNA基因；dnaA；rpoB

0 引 言

肠膜明串珠菌为革兰氏阳性兼性厌氧且不产芽孢的球形细菌，常存在于植物体表[2]，目前包括肠膜明串珠菌葡聚糖亚种、乳脂亚种、肠膜亚种和最新分离得到的Leu.mesenteroides subsp.suionicum[6-7]，它们均在食品工业中扮演重要角色[3]，然而传统的生理生化反应以及16S rRNA基因序列因自身局限不足以对近缘种或亚种进行分类鉴定[2，9-10]，因此，有必要为其在工业上的应用提供快速准确的分类鉴定方法，看家基因作为重要蛋白的编码基因，进化速率快且分辨能力强，特别适用于近缘菌株的区别和鉴定[12]。

本研究利用16S rRNA基因序列结合dnaA和rpoB的部分看家基因序列分析了分离自发酵乳制品中的8株试验菌株的系统发育关系，充实多相分类鉴定以便分类学地位准确无误，为其在工业上的应用提供快速准确的鉴定方法。

1 实 验

1.1 材料

（1）实验菌株。本文所用的8株肠膜明串珠菌均由内蒙古农业大学乳品生物技术与工程教育部重点实验室提供，试验菌株的16S rRNA基因、dnaA和rpoB基因序列登录号见对应系统发育树图括号内所示。

（2）主要试剂和仪器。Applied biosystems PCR仪，ND-1000型微量紫外分光光计，CDS8000型UPV凝胶成像分析系统，DHP-9272型电热恒温培养箱，HZS-H水浴震荡器，PL303/01电子天平，Eppendorf 5810R高速冷冻离心机，ML-30L型全自动高压蒸汽灭菌器，DYY-12电泳仪等。

（3）实验所用引物。通过比较基因组学分析，选择dnaA和rpoB两个单拷贝且含有多变区的基因为目标序列，结合序列比对信息，采用Prim er 5.0设计通用引物并由上海美吉生物医药科技有限公司合成，引物信息如表1所示。

表1 PCR扩增引物

1.2 DNA提取、PCR扩增和测序

菌体DNA提取采用CTAB-液氮冻融法[13]，在此基础上针对本实验样品改进后具体步骤为：取适量菌体于1.5m L的EP管中，加入500μL TE缓冲液并用吸管反复吹打，使之重悬，置于液氮中反复冻融3-4次，然后加入80μL质量浓度为100 g/L的SDS和10μL质量浓度为20 g/L的蛋白酶K，混匀，于37℃摇床4 h。再加入80μL浓度为10 m o l/L的CTAB溶液及100μL浓度为5mo l/L的NaC l溶液，混匀，于65℃水浴30m in，得到粗提取液。在此粗提取液中，加入700μL酚/氯仿/异戊醇（V酚∶V氯仿∶V异戊醇=25∶24∶1），颠倒混匀，离心（12 000 g，10 m in）；取上清，并加入700μL氯仿/异戊醇（V氯仿∶V异戊醇=24∶1），颠倒混匀，离心（12 000 g，10 m in），取上清，加入500μL冷的异丙醇和50μL 3 m ol/L的N aAc，轻轻混合，直到DNA沉淀下来，离心（12 000 g，10 m in）后，弃去上清，得到DNA沉淀，用500μL 70%的乙醇洗涤DNA两次。最后用50μL TE溶解DNA，并加入适量R NaseA，4℃放置过夜后，将提取的基因组DNA稀释到100μg/L作为PCR扩增模板，反应体系50μL。其中dnaA基因的扩增条件为：95℃预变性5 m in；95℃变性1 m in，52℃退火45 s，72℃延伸1 m in，30个循环；72℃末端延伸10 m in。rpoB基因扩增条件的除了退火温度为56℃，其余反应条件均与dnaA一致。PCR扩增产物的质量用1.2%的琼脂糖凝胶电泳检测，并将扩增成功的PCR产物送上海美吉生物医药科技有限公司测序。

1.3 序列分析与系统发育树的构建

8株试验菌株的dnaA和rpoB基因扩增产物经纯化、测序获得相应的核苷酸序列。然后从GenBank数据库中下载试验菌株、参考菌株的16S rRNA基因序列，以及参考菌株的dnaA和rpoB基因序列（序列登录号见对应系统发育树图括号内所示），采用M ega6.0软件进行C lustalW比对，运用邻接法（Neighour-joining，N-J）分别构建试验菌株、参考菌株的16S rRNA基因和dnaA、rpoB部分基因序列的系统发育树，数据自展重抽样次数1 000次。

2 结果和分析

2.1 基于16S rRNA基因的系统发育分析

8株试验菌株和6株参考菌株的16S rRNA基因序列下载自GenBank核酸序列数据库。通过多重序列比对，获得比对整齐的序列文件并构建系统发育树。结果显示，共划分出A、B、C 3个较为稳定的大类群。其中，8株试验菌株和Leu.mesenteroides subsp.mesenteroides ATCC 8293T、Leu.mesenteroides subsp.cremoris ATCC 19254T聚为A类群，它们两两之间的16S rRNA基因序列的平均相似性等于或大于99%；A类群与B类群Leu.pseudomesenteroides分支的平均相似性为99.5%，与C类群leu.citreum的平均相似性为98.1%，这与Saw a[14]、Elizaqunvel[15]、Laguerre[16]等人的研究结论一样，即肠膜明串珠菌与其近缘种的16S rRNA基因序列相似性高且进化速率较低，因此当对肠膜明串珠菌亚种及其近缘种之间进行区别时，需要选用一种较16S rRNA基因分辨率高的方法及工具。

图1 8株试验菌株与参考菌株的16S rRNA基因系统发育树

2.2 dnaA和rpoB部分基因序列的系统发育分析

图2 8株试验菌株与参考菌株的dnaA、rpoB基因系统发育树

基于dnaA部分基因序列构建的系统发育树中（图2），8株试验菌株与6株参考菌株构建的系统发育树的拓扑结构与16S rRNA基因的基本相同，仍形成A、B、C 3大类群，区别在于相似性不同，其中A类群与B类群两两菌株之间的基因平均相似性为84.8%，与C类群之间基因平均相似性为81.7%，这表明相较于16S rRNA基因序列，dnaA基因序列在鉴定明串珠菌属内各近缘种的系统发育关系时分辨率更高。但遗憾的是，dnaA基因同源性不足以区分肠膜明串珠菌的亚种，模式菌株Leu.mesenteroides subsp.mesenteroides ATCC 8293T和Leu.mesenteroides subsp.cremoris ATCC 19254T的基因相似性为100%，可能的原因是由于用于本文构建系统发育树的dnaA基因片段长度仅312 bp，未能提供足够的序列信息造成。

基于rpoB部分基因序列构建的系统发育树中（图2），8株试验菌株与6株参考菌株仍形成较为稳定的A、B、C 3大类群，其中A类群与B类群菌株两两之间基因的平均相似性为87.4%，与C类群之间基因平均相似性为85.5%，分辨率高于16S rRNA基因，类似地，Shevtsov等人也表明rpoB基因在分析乳杆菌属内近缘种的亲缘关系时较16S rRNA分辨率高[17]。另外在亚种水平上，试验菌株（A类群）可明显分为3个分支，其中IM AU 80244、IM AU 80358、IM AU 20659、IM AU 10406与模式菌株Leu.mesenteroides subsp.mesenteroides ATCC 8293T聚为Ⅰ亚群，IM AU 20671、IM AU 80420与模式菌株Leu.mesenteroides subsp.cremoris ATCC 19254T聚为II亚群。IM AU 80347与IM AU 80748未与参考菌株划分为一类，它们与模式菌株Leu.mesenteroides subsp. mesenteroides ATCC 8293T的相似性为99.5%，与模式菌株Leu.mesenteroides subsp.cremoris ATCC 19254T的相似性为99.1%。

另对构建系统发育树的8株试验菌株以及参考菌株的dnaA、rpoB及16S rRNA的基因序列进行了多态性分析（表2），结果表明，2个看家基因的多态性位点比率均比16S rRNA基因高，dnaA基因的多态性位点比率最高，为27.1%，rpoB基因多态性位点比率为21.24%，远高于16S rRNA基因的2.52%。遗传距离可以反映同属不同种之间基因差别的程度，结果显示各看家基因的遗传距离也均大于16SRNA。综上所述看家基因相较于16S rRNA基因在区分肠膜明串珠菌近缘种及亚种时有着更高的分辨率，其中rpoB可明晰区分试验菌株与肠膜明串珠菌亚种间的系统发育关系，因此rpoB基因可作为16S rRNA基因的辅助工具用于Leu.mesenteroides及其近缘种的快速分离鉴定。

表2 肠膜明串珠菌16S rRNA基因及看家基因多态性分析

表2中，保守性位点、多态性位点数、多态位点比率为多态性位点与所有位点的比值由DNAsp5得出，各基因比对后片段长度、基因距离与基因距离平均值则由MEGA6.0计算得出。

3 讨 论

细菌16S rRNA基因兼有保守区与可变区，使得它成为研究细菌分类进化的重要工具[18-19]，然而随着生物信息学的日益发展科研人员发现，16S rRNA基因在区分近缘种时往往显示出较低的分辨率[9-10]。张文羿[9]等人利用看家基因clpx、recA将经传统生理生化和16S rRNA基因序列鉴定的9株Enterococcus faecium和1株Enterococcus durans重新划分为Enterococcus faecalis，成功将16S rRNA基因无法区分的菌株准确鉴定到种水平。2007年，Bruyne[20]等人对分离自埃塞俄比亚咖啡中的乳酸菌的16S rRNA基因序列进行了分析鉴定，结果表明这株菌与Leuconostoc cireum（Leu.cireum）以及Leuconostoc lactis(Leu.lactis)的16S rRNA基因序列相似性分别是99.6%和99.0%，故未能将其准确划分到种水平，但通过联合看家基因、DNA杂交等技术将分离得到的菌株划分为新种Leuconostoc holzapfeliisp. nov.。类似地，吕嫱[10]等人对比研究了16S rRNA基因以及dnaA、murC和pyrG看家基因序列对Leu.cireum、Leu.lactis的区分能力，结果表明：看家基因相较于16S rRNA基因具有更高的分辨率，在研究近缘种的系统发育关系时更具有优势。早前有研究指出肠膜明串珠菌与柠檬明串珠菌、假肠膜明串珠菌等近缘种的16S rRNA基因序列相似性大于97%[14-16]，因此仅利用16S rRNA基因序列无法对其进行准确区分，本文构建的系统发育树也证明了这一结论，因此本文研究肠膜明串珠菌及其近缘种的亲缘关系选用了分辨率更高的看家基因序列作为辅助工具，这样一来，克服了16S rRNA基因的局限性。

本研究通过比较16S rRNA基因，dnaA和rpoB基因的构建的N-J树发现，看家基因与16S rRNA基因表现出了较高的一致性，表明本文所选的看家基因可以作为16S rRNA基因的辅助工具用于今后明串珠菌属内近缘种的快速准确鉴定，另外利用rpoB基因构建的系统发育树在亚种水平的区分能力高于dnaA，但遗憾的是，亚种之间的差异性小于1%，因此需要进一步联合分辨率高的看家基因或通过传统生理生化鉴定与分辨率高的看家基因相结合来区分肠膜明串珠菌亚种的系统进化地位。

[1]POGACIC T，CHUAT V，MADEC M N，et al.Phenotypic traits of genetically closely related Leuconostoc spp[J].International Dairy Journal，2014，39(1)：96-101.

[2]HEMME D.Leuconostoc and its use in dairy technology[M].Florida：CRC Press Boca Raton，2012：73-108.

[3]李文斌，宋敏丽，高荣琨.肠膜明串珠菌的研究和应用进展[J].食品工程，2006(4)：3-4.

[4]JUNG JY，LEE S H，LEEH J，et al.Effects of Leuconostoc mesenteroides starter cultures on microbial communities and metabolites during kimchi fermentation[J].International Journal of Food Microbiology，2012，153(3)：378-387.

[5]KIM DC，CHAE HJ，IN M-J.Fermentation characteristics of Korean pear(Pyrus pyrifolia Nakai)puree by the Leuconostoc mesenteroides 51-3 strain isolated from Kim chi[J].African Journal of Biotechnology，2013，9(35)：5735-5738.

[6]GARVIE EI.Leuconostoc mesenteroides subsp.cremoris(Knudsen and Sorensen)comb.nov.and Leuconostoc mesenteroides subsp.dextranicum(Beijerinck)comb.nov[J].International Journal of Systematic&Evolutionary Microbiology，1983，(1)：118-119.

[7]GU CT，WANG F，LICY，et al.Leuconostoc mesenteroides subsp.suionicum subsp.nov[J].International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology，2012，62(7)：1548-1551.

[8]罗靳，杨雅麟，王建华.肠膜明串珠菌右旋糖苷蔗糖酶的研究进展[J].微生物学通报，2007，34(4)：787-790.

[9]张文羿，吕嫱，徐海燕，等.粪肠、屎肠球菌及相近种部分持家基因的系统发育分析[J].微生物学通报，2014，41(2)：297-303.

[10]吕嫱，陈明，徐海燕，等.柠檬明串珠菌及相近种部分持家基因的系统发育分析[J].微生物学报，2013，53(7)：669-676.

[11]BARRANGOU R，YOON SS，BREIDT F JR，et al.Identification and characterization of Leuconostoc fallax strains isolated from an industrial sauerkraut fermentation[J].Applied and Environmental Microbiology，2002，68(6)：2877-2884.

[12]陈伟峰，洪舒音，赵秀玲.蛋白编码基因在细菌分类学中的应用[J].生物技术通报，2012(5)：42-48.

[13]乌日娜，张和平，孟和毕力格.酸马奶中乳杆菌Lb.casei.Zhang和ZL12-1的16S rDNA基因序列及聚类分析[J].中国乳品工业，2005，33(6)：4-9.

[14]SAWA N，OKAMURA K，ZENDO T，etal.Identification and characterization of novel multiple bacteriocins produced by Leuconostoc pseudomesenteroides QU 15[J].Journal of General and Applied Microbiology，2010，109(1)：282-291.

[15]ELIZAQU IVEL P，CHENOLL E，AZNAR R.et al.A Taq-M an-based real-time PCR assay for the specific detection and quantification of Leuconostoc mesenteroides in meat products[J].FEMS microbiology Letters，2008，278(1)：62-71.

[16]LAGUERRE S，AMARI M，VUILLEM IN M，et al.Genome sequences of three Leuconostoc citreum strains，LBAE C 10，LBAE C11，and LBAE E16，isolated from wheat sourdoughs[J].Journal of Bacteriology，2012，194(6)：1610-1611.

[17]SHEVTSOV A，KUSHUGULOVA A，KOJAKHMETOV S，et al. Detection of Lactobacillus species using a gene fragment of the RNA polymerase beta subunit rpoB[J].Moscow University Biological Sciences Bulletin，2011，66(1)：22-27.

[18]STACKEBRANDT E，FREDERIKSEN W，GARRITY GM，et al. Report of the ad hoc committee for the re-evaluation of the species definition in bacteriology[J].International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology，2002，52(3)：1043-1047.

[19]杨玲玲，职晓阳，李文均.拟诺卡氏菌16S rRNA，gyrB，sod和rpoB基因的系统发育分析[J].微生物学报，2007，47(6)：951-955.

[20]DE BRUYNE K，SCH ILLINGER U，CAROLINE L，et al.Leuconostoc holzapfelii sp.nov.，isolated from Ethiopian coffee fermentation and assessment of sequence analysis of housekeeping genes for delineation of Leuconostoc species[J].International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology，2007，57(12)：2952-2959.

Phylogenetic analysis of closely related Leuconostoc mesenteroides species based on dnaA and rpoB gene homologues

FENG Shu-zhen，XU Hai-yan，SONG Yu-qing，ZHANG He-ping，SUN Zhi-hong
(Key Laboratory of Dairy Biotechnology and Engineering，Ministry of Education，Inner Mongolia Agricultural University，Hohhot 010018，China)

The study aimed to compare the efficiency of 16S rRNA，dnaA，rpoB gene on the phylogenetic relationship of Leu.mesenteroides and its related species，to provide a rapid identification method of the Leu.mesenteroides strains.Two housekeeping genes，dnaA and rpoB gene，of eight Leu.mesenteroides strains originally isolated from traditional dairy products were used as phylogenetic markers to construct the phylogenetic trees with the published corresponding gene sequences of reference strains in Genbank.The phylogenetic trees of 16S rRNA gene of tested strains and reference strains were also constructed.The topologies of the two housekeeping genes trees were consistent with that of 16S rRNA gene.How ever，homology of the close related Leu.mesenteroides species based on dnaA，rpoB and 16S rRNA gene sequences was different，ranging from 81.7%to 84.8%，85.5%to 87.4%，and 98.1%to 99.5%，respectively.Com pared with 16S rRNA gene，the dnaA and rpoB gene，were more appropriate for phylogenetic identification of Leu.mesenteroides and its related species.Meanwhile，considering the rpoB gene is competent to distinguish the test strains at the subspecies level，it can be used as an auxiliary tool for rapid classification and identification of Leu.mesenteroides and its related species.

Leu.mesenteroides；phylogenetic analysis；16SrRNA gene；dnaA；rpoB

Q93-33

：A

：1001-2230（2016）02-0008-04

2015-09-02

国家自然科学基金项目（31430066）；国家高技术研究发展计划（2011AA100901）。

冯淑贞（1990-），女，硕士研究生，研究方向为乳品生物技术。

孙志宏