乳清蛋白肽对自然衰老小鼠抗氧化效果及脑内乙酰胆碱脂酶的影响

（东北农业大学食品学院，哈尔滨150030）

乳清蛋白肽对自然衰老小鼠抗氧化效果及脑内乙酰胆碱脂酶的影响

齐微微，卞辑，于广吉，姚宇秀，郭佩佩，王艳菲，于国萍

（东北农业大学食品学院，哈尔滨150030）

利用碱性蛋白酶水解制得的乳清蛋白肽（W PP），以青年小鼠、自然衰老的小鼠和灌胃脑复康的自然衰老的小鼠作对照，以灌胃低中高剂量乳清蛋白肽即100，200和400mg/(kg·d)自然衰老的小鼠为实验组，通过体内抗氧化指标（SOD、MDA、GSH-Px、蛋白质羰基）和脑内乙酰胆碱脂酶来研究乳清蛋白肽对自然衰老的小鼠抗氧化效果及乙酰胆碱脂酶活力的影响，并探究WPP对老龄小鼠学习记忆的影响。灌胃乳清蛋白肽自然衰老小鼠的SOD和GSH-Px活性显著增加，MDA和蛋白质羰基浓度显著降低，同时乙酰胆碱脂酶的活性也有所降低，高剂量组与脑复康对照组结果相近；实验结果表明乳清蛋白肽能显著提高自然衰老小鼠抗氧化能力，并能调节脑组织乙酰胆碱酯酶的活性，提高衰老小鼠学习记忆认知功能。

乳清蛋白肽；自然衰老的小鼠；体内抗氧化；乙酰胆碱脂酶

0 引 言

近年来，生物活性肽以其吸收快和生物活性方面的优势已成为蛋白质营养研究的热点之一。而乳源性活性肽以其独特的营养价值备受关注[1]。国内外研究发现，乳清蛋白的水解产物相对分子质量主要分布在300～1400，并且绝大部分集中在1000以下[2-3]。现有研究显示，乳清蛋白水解可得到清除羟自由基的小肽[4-5]；Nagaoka S用胰蛋白酶水解乳清蛋白，成功的分离出一种能够降低血清胆固醇的五肽[6]；人们还从乳清蛋白的胰凝乳蛋白酶水解物分离出一种对某些神经受体具有抑制功能的活性肽[7,8]。包怡红[3]，彭新颜[9]等研究了乳清蛋白肽对D-半乳糖衰老模型抗氧化的影响，但是关于乳清蛋白肽对自然衰老的小鼠抗氧化的影响研究少有报道。

1 实 验

1.1 材料与试剂

浓缩乳清蛋白(W PC 80)，蛋白质质量分数78.29%，碱性蛋白酶，1.75×105U/g，昆明种雌雄小鼠，SOD试剂盒，MDA试剂盒，GSH-Px试剂盒，蛋白羰基试剂盒，AChE试剂盒，其余所有试剂均为分析纯。

1.2 主要仪器

UVmini-1240紫外可见分光光度计，LD 4-2A型低速离心机，万能粉碎机，RE-52型旋转蒸发仪。

1.3方法

1.3.1 乳清蛋白抗氧化肽的制备

乳清蛋白肽的制备参考文献[10]的方法，以DPPH自由基清除率为指标，对乳清蛋白肽进行脱盐、超滤分离，筛选出抗氧化活性最高的组分（分子量小于3 ku），将其冷冻干燥成粉末，以备下一步实验。

1.3.2 乳清蛋白肽对各组小鼠的作用

动物饲养：取雌雄昆明种小鼠80只，等量、分笼饲养，自然衰老的小鼠16～18月龄，青年小鼠3月龄，体质量（20.0±2.0）g，适应性饲养1周后，用M orris水迷宫系统筛选，剔除漂在水面上的老龄小鼠，剩余72只。随机分组（如表1），每组12只，每5天称1次体重，老年模型组（B）和青年对照组（A）每天灌胃等量生理盐水。脑康复对照组（C）灌胃200m g/(kg·d)脑复康药片。低、中、高剂量组（D、E、F）灌胃的乳清蛋白肽溶液是由超滤分离出的分子量小于3ku的小分子肽冻干粉配制而成。

表1 动物实验分组方案

按照上面的方法，连续喂养30 d后，将小鼠禁食24 h，取血后将其脱颈处死，立即取出脑、心脏、肾脏、肝脏组织，计算其脏器指数，计算公式为

按相应试剂盒说明测定血清、肝、脑组织中的超氧化物歧化酶（SOD）活力、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）活力、丙二醛（M DA）浓度、蛋白质羰基浓度和脑内乙酰胆碱酯酶活力。

1.4 统计分析

文中数据均使用SPSS18.0软件进行统计分析，所用数据均为三次的平均数，误差项为标准误，单因素方差分析（ANOVA）中采用Duncan检验，图表中标有相同字母者为差异不显著，有不同字母者为差异显著（P≤0.05）。作图采用Sigma Plot 9.0软件。

2 结果与分析

2.1 对各组小鼠脏体比的影响

实验后摘取各组小鼠的脏器，称重并计算各脏器指数，如表2所示。由表2可以看出，与B组相比，A组、C组和乳清蛋白肽剂量组的各脏器指数均显著升高，与青A组相比，乳清蛋白肽剂量组的各脏器指数均显著降低，与C组相比，乳清蛋白肽中、高剂量组的心脏指数无显著性变化，高剂量组的肾指数无显著性变化，由此可见，乳清蛋白肽可以使自然衰老小鼠的脏器得到不同程度的修复。

表2 乳清蛋白肽对各组小鼠心指数、肝指数、肾指数和脑指数的影响 %

2.2 对各组小鼠血清、肝脏和脑内SOD活性的影响

超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase，SOD)是重要机体内抗氧化酶之一，可以清除自由基，延缓机体衰老。图1表明，在血清、肝脏和脑组织中，B组的SOD活性显著低于其它各组，而A组的SOD活性显著高于其他各组。在血清、肝脏和脑组织中GSH-Px的活性（图2）与SOD活性的变化相一致；MDA的浓度（图3）和蛋白羰基浓度（图4）的变化规律相反，B组的M DA浓度与蛋白质羧基浓度明显高于其他各组，而A组的则明显低于其他各组。这表明自然衰老的小鼠体内的抗氧化能力降低，通过灌胃乳清蛋白肽或脑复康药剂可以提高其抗氧化能力，但是不及青年小鼠自身的抗氧化能力强。

在肝组织中，乳清蛋白肽剂量组的SOD活性高于C组，且各组之间存在显著性差异；在血清中，乳清蛋白肽D组的的SOD活性显著低于C组，乳清蛋白肽E、F组显著高于C组，且两组之间无显著性差异；在脑组织中，乳清蛋白肽E组显著低于脑复康对照组，高剂量组与脑复康对照组之间无显著性差异。由此看来，乳清蛋白肽能够有效提高衰老小鼠血清、肝组织、脑组织中的SOD活性，且高剂量组效果达到甚至优于脑复康的效果，说明W PP对衰老小鼠血清、肝和脑的SOD活性具有增强作用，其中血清的SOD活性增强非常显著，与包怡红的研究结果类似[3]。

图1 各组小鼠血清、肝脏和脑的SOD活性

2.3对各组小鼠血清、肝脏和脑内GSH-PX活性的影响

谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px)是广泛存在于机体内的一种重要的过氧化物分解酶，可以清除细胞代谢过程中产生的过多的羟自由基和过氧化物，减轻细胞膜的过氧化作用，GSH同时还能促进H2O2分解，从而使过氧化物无法对细胞膜造成损害[11]，可以起到保护细胞膜结构和功能完整的作用。在肝脏和脑组织中（图2），乳清蛋白肽D、E组的GSH-Px活性低于C组，F组高于C组，且各组之间存在显著性差异，表明随着乳清蛋白肽剂量的增加，GSH-Px活性逐渐提高，作用越明显，SOD活性在低中高剂量组的灌胃下的变化（图1）与GSH-Px活性变化类似，呈现一定剂量依赖关系；在血清中，乳清蛋白肽各剂量组的GSH-Px活性高于C组，且各组之间存在显著性差异。由此看来，乳清蛋白肽能够有效提高衰老小鼠血清、肝组织、脑组织中GSH-Px活性，且高剂量组效果优于脑复康对照组。

图2 各组小鼠血清、肝脏和脑的GSH-PX活性

2.4 对各组小鼠血清、肝脏和脑内MDA浓度的影响

体内自由基可以与脑内细胞膜上含量丰富的不饱和脂肪酸相结合，发生脂质过氧化反应，造成细胞损伤，同时生成毒性物质丙二醛（m alondialdehyde，M DA），M DA能够影响细胞代谢及功能、结构的改变，促进细胞的凋亡，抑制生物信息传递，降低机体的智力水平和学习记忆能力[12,13]。因而测试M DA的量常常可反映机体内脂质过氧化的程度，间接反映机体细胞的受氧化损伤程度。

在肝、血清和脑组织中，青年对照组的MDA浓度和蛋白羰基显著低于其余各组（图3和4），说明脑复康药物、乳清蛋白肽的效果目前还达不到青年小鼠的程度。在肝组织中（图3），乳清蛋白肽D组的M DA显著高于C组，E组显著低于C组，F与C组之间无显著性差异；在血清和脑组织中，乳清蛋白肽E、F组的M DA显著低于C组，D组与C组之间无显著性差异；由此看来，乳清蛋白肽能够有效降低衰老小鼠血清、肝组织、脑组织中MDA，且中剂量组和高剂量组之间效果基本相同，效果优于脑康复组，表明W PP对动物体内脂质过氧化终产物的生成有较强抑制作用，抗氧化作用明显。

图3 各组小鼠血清、肝脏和脑的MDA浓度

2.5 对各组小鼠血清、肝脏和脑内蛋白羰基浓度的影响

蛋白质羰基是蛋白质分子被自由基氧化的重要产物之一，通过测定羰基浓度可以判定蛋白质受氧化损伤的程度。

在肝脏中，乳清蛋白肽E、F组蛋白羰基浓度显著低于D组，而二者之间无显著性差异（图4）；在血清和脑组织中，乳清蛋白肽三个剂量组的蛋白羰基浓度之间均存在显著性差异，但均高于C组。由此看来，乳清蛋白肽虽能够有效降低衰老小鼠血清、肝组织、脑组织中蛋白羰基浓度，防止中枢神经系统受到自由基的损伤，其中高剂量组效果最好，但均未达到脑复康对照组的效果。

图4 各组小鼠血清、肝脏和脑的蛋白羰基浓度

2.6 对各组小鼠脑内乙酰胆碱脂酶（AChE）的影响

乙酰胆碱(A c h)是脑内的经典神经递质,与认知、学习、记忆等大脑高级神经功能有关。学习记忆任务的完成伴随着脑内乙酰胆碱的变化[14]。AChE是Ach的水解酶，它的活力变化可间接反映脑内乙酰胆碱含量和代谢情况。衰老小鼠脑组织中AChE活性显著升高，造成Ach含量不足，导致中枢神经系统功能障碍，出现学习记忆及认知功能下降，甚至智力丧失。因此AChE活性的检测可以作为评价学习记忆功能的主要指标。

由实验结果可知（图5），在脑组织中，乳清蛋白肽剂量组的AChE活性显著低于B组，显著高于A和C组，说明乳清蛋白肽可以通过降低AChE活性而减少Ach的分解，提高脑组织中Ach的含量，在一定程度上改善自然衰老小鼠的学习记忆能力。

图5 各组小鼠脑AChE活性

3 结 论

灌胃乳清蛋白肽的自然衰老小鼠的SOD和GSH-Px活性明显增加，M DA和蛋白质羰基浓度明显降低，且呈剂量依赖关系，高剂量组的效果最好，与脑复康对照组效果相近。但乳清蛋白肽的效果目前还达不到青年小鼠的程度。

灌胃乳清蛋白肽降低了老龄小鼠脑内AChE活性，证明乳清蛋白肽能够通过降低AChE的活性来降低Ach的分解，但效果不及脑复康。

乳清蛋白肽能够清除机体内堆积的自由基，阻止自由基攻击生物膜中的多不饱和脂肪酸引发脂质过氧化作用，减少细胞的氧化损伤，从而降低中枢神经系统受损的程度，起到延缓衰老，改善学习记忆力的作用。乳清蛋白肽或许也可以通过调节中枢胆碱能神经系统的活动来改善学习记忆能力，关于具体机制还有待进一步探讨。

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Influence of whey protein antioxidant peptides on antioxidant and AChE of natural aged mice

QI Wei-wei,BIAN Ji,YU Guang-ji,YAO Yu-xiu,GUO Pei-pei,WANG Yan-fei,YU Guo-ping
(College of food science,N ortheast Agricultural University,Harbin 150030，China)

Whey protein peptides were prepared by alkaline protease hydrolysis.Compared with the young mice,natural aged mice and mice treated by piracetam tabletsas as control groups,them ice were given three different doses of WPP,100,200,400mg/(kg·d)respectively as experimental groups.Whey protein peptides were quantified as the vivo antioxidant index(SOD,MDA,GSH-Px and protein carbonyl)and AChE of brain tissue to observe the affect of Antioxidant and the in aged mice,and learning and memory ability.The results showed that after gavage whey protein peptides,SOD and GSH-Px activity in aged mice were significantly increased,MDA and protein carbonyl content were significantly decreased;AChE activity was also decreased.High-dose group has similar results with the piracetam tablets control group. Whey protein peptide can significantly improve antioxidant ability of natural aged m ice,and adjust activity of AChE of brain tissue,therefore improve the ability of learning and cognitive function.

whey protein peptides;natural aged mice;antioxidant;AChE

Q936

：A

：1001-2230（2016）02-0004-04

2015-07-16

“十二五”农村领域国家科技计划课题（2013BAD 18B07-03）。

齐微微（1989-），女，硕士研究生，研究方向为食品化学。

于国萍