鸟胞内分枝杆菌mmpL11同源基因序列分析及功能预测

王文靖，孙　妍，王心倩，余晓丽*

(1.南阳市第二中学，河南 南阳 473000；

2. 武汉轻工大学生物与制药工程学院，武汉 430023)



鸟胞内分枝杆菌mmpL11同源基因序列分析及功能预测

王文靖1，孙妍2，王心倩2，余晓丽2*

(1.南阳市第二中学，河南 南阳 473000；

2. 武汉轻工大学生物与制药工程学院，武汉 430023)

摘要：以非结核分枝杆菌中的胞分枝杆菌、鸟分枝杆菌两个标准株为研究对象，以耻垢分枝杆菌mc2 155和结核分枝杆菌H37Rv为对照，对其mmpL11同源基因进行序列分析，并对其蛋白质进行结构及功能预测，为后期的抗酸染色阳性菌诊断，药物靶标的筛选提供理论基础。根据同源比对找到两个标准株的mmpL11同源基因；应用expasy工具预测MmpL11同源蛋白理化性质；蛋白质信号肽预测采用SignalP在线软件进行预测；使用TMHMM在线工具进行拓扑结构预测；利用Interproscan工具对蛋白保守序列和功能进行预测；使用SSpro对蛋白二级结构进行预测。OCU48920蛋白的理化性质分析显示：其氨基酸个数为1 018，分子量为108.4 kD，理论等电点为7.61，疏水指数为0.227；MAP3637c蛋白的理化性质分析显示：其氨基酸个数为1 007，分子量为107.2 kD，理论等电点为8.59，疏水指数为0.231。信号肽预测发现两个标准株的MmpL11均不存在信号肽切割位点，未发现信号肽存在。跨膜预测发现其跨膜次数分别为12和12肽链，N端均在膜内，二级结构以α-螺旋和β-片层为主。保守序列预测发现两个标准株的MmpL11蛋白均有两个MMPL跨膜结构域，一个固醇敏感多肽区。OCU48920、 MAP3637c为H37Rv的MmpL11同源蛋白，推测其功能同MmpL11相似，是分枝菌酸的转运蛋白，参与胞内小分子的运输和信号转导。

关键词：非结核分枝杆菌；MmpL11；序列分析；功能预测

鸟胞内分支杆菌复合体(Mycobacteriumavium-intracellularecomplex，MAC)是细胞内寄生的病原体，在吞噬细胞内增殖，并能引起AIDS病人的机会性感染。一般说来，目前市场上有效的药物单用，甚至多药联合都难以根治MAC感染[1]。是非结核分枝杆菌(NontuberculosisMycobacteria，NTM)为抗酸染色阳性菌，临床症状多与结核分枝杆菌感染相似，容易误诊为由结核分枝杆菌感染引起的结核病，且对多种抗结核药物具有耐药性[2-3]。

MmpL蛋白家族是分枝杆菌耐受-结节-分裂家族(Resistance-nodulation-cell division family,RND家族)超家族蛋白中的一种膜蛋白，是影响分枝杆菌的生存和毒力的关键因子之一，在结核分枝杆菌中包括MmpL1-13[4]。

RND家族中固醇敏感多肽区(SSD domain)在胆固醇自我平衡调节、物质运输以及细胞信号转导中发挥重要的作用[5]。此外，研究发现，在基因组中，有大约20%～30%的基因产物被预测为膜蛋白，在药物研发过程中，膜蛋白偶联受体是绝大多数药物的作用靶点，跨膜蛋白在生物体中担负着各种各样的重要功能：细胞的运输，细胞膜内外信号的传递及能量转换等[6]。由于膜蛋白数量巨大而且功能多样，因此通过跨膜蛋白的拓扑结构能对其功能进行初步预测。

以非结核分枝杆菌胞分枝杆菌、鸟分枝杆菌标准株为研究对象，耻垢分枝杆菌标准株和H37Rv为对照，对其MmpL11进行同源性分析、理化性质分析、信号肽预测、跨膜结构预测、保守序列和二级结构预测以及蛋白质功能预测，为进一步阐明抗酸染色阳性非结核分枝杆菌的毒力、致病机制和疾病研究提供理论依据。

1方法和步骤

1.1方法

运用生物信息学方法，通过序列对比，理化性质分析，信号肽预测，跨膜结构预测，保守序列，二级结构分析等生物信息学手段[7]，对胞分枝杆菌(M.intracellulareATCC13950)，鸟分枝杆菌(M.aviumsubsp.paratuberculosisK-10)，耻垢分枝杆菌(M.smegmatistrmc2 155)的MmpL11进行同源序列分析及功能预测。

1.2步骤

1.2.1MmpL 11同源序列比对

在NCBI数据库中查找结核分枝杆菌(MTB)H37Rv的MmpL11的氨基酸序列，在BLAST搜索两个标准株的同源序列。

1.2.2MmpL11理化性质分析

用 ExPASy 在线序列分析工具，对MmpL11蛋白理化性质进行预测。

1.2.3MmpL 11信号肽预测

用SSpro(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)在线软件对MmpL11进信号肽预测。

1.2.4MmpL11跨膜结构、保守序列和二级结构分析

用TMHMM Server 2.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)在线软件对MmpL11进行拓扑结构预测。用Interproscan(http://www.ebi.ac.uk/interpro/scan.html)对MmpL11同源序列进行保守序列和结构域分析。用SSpro对MmpL11同源序列进行二级结构预测。

2结果

2.1MmpL11同源序列比对

同源分析结果显示：与H37Rv的MmpL 11比较，胞分枝杆菌同源序列为OCU48920 (Ident，72%)，鸟分枝杆菌为MAP3637c (Ident，76%)，耻垢分枝杆菌为MSMEG0241 (Ident，69%)。

2.2MmpL11理化性质分析

用 ExPASy 在线序列分析工具，对MmpL11蛋白理化性质进行预测，见表1。

2.3MmpL 11信号肽预测

用SSpro(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)在线软件对MmpL11进信号肽预测，信号肽分析显示两个标准株的MmpL11蛋白均不存在信号肽切割位点，未发现信号肽存在。

2.4MmpL11跨膜结构、保守序列和二级结构分析

用TMHMM 2.0软件对MmpL11及其同源序列跨膜结构预测，胞分枝杆菌，鸟分枝杆菌，耻垢分枝杆菌的MmpL11同源蛋白跨膜次数分别为12、12、11，且同源蛋白的肽链N短都分布在膜内见图1(a-d)。

表1　MmpL11蛋白理化性质

图1　MmpL11跨膜结构预测Fig.1　Transmembrane structure prediction of MmpL11

H37Rv的MmpL11结构域预测显示具有两个膜转运蛋白(MMPL domain)结构域和一个固醇敏感多肽区(Sterol-sensing domain, SSD)，两个标准株的MmpL11同源蛋白均有两个膜转运蛋白结构域和一个 SSD结构域，说明该同源序列既有膜转运功能又有 SSD结构域介导的胆固醇自我平衡调节、物质运输以及细胞信号转导功能见图2(a-d)。

用SSpro对MmpL11同源序列进行二级结构预测，分析显示两个标准株的二级结构均以α-螺旋和β-片层为主。

3讨论

MmpL家族蛋白是一组与结核分枝杆菌药物外排有关的一个跨膜蛋白家族，可作为抗结核药物或菌种鉴定药物提供靶位点。研究发现在耻垢分枝杆菌中MmpL11具有摄取血红素，转运多分枝酰基二酰基甘油(MMDAG)和霉菌酸蜡脂(WE)的功能[8-13]。我们推测在耻垢分枝杆菌中MmpL11可能参与胞壁含分枝菌酸的脂类运输和脂类代谢。胞壁分枝菌酸在结核分枝杆菌的抗酸染色、生长特性、致病性和抵抗力等密切相关[14]。

两个标准株的MmpL11同源序列OCU48920、MAP3637c、MSMEG0241 与H37Rv的同源性分别为72%、76%、69%。通过理化性质、跨膜分析、信号肽预测和结构域分析显示：两个标准株的MmpL11同源序列具有疏水性，其跨膜蛋白不存在信号肽，具有一个SSD结构域等。

图2　MmpL11跨膜结构Fig.2　Transmembrane domain of MmpL11

结构域分析发现两个标准株的MmpL11蛋白均有两个MMPL膜转运功能区(MMPL domain)和一个固醇敏感多肽区(SSD domain)，推测其可能不仅具有膜转运功能也可能具有SSD结构域在胆固醇自我平衡调节、物质运输以及细胞信号转导中的作用。

4结论

通过对mmpL11基因的信息学预测，为后续深入研究MmpL11蛋白的生物学功能、验证 MmpL11作为药靶的候选蛋白的可行性提供基础资料，并得出如下结论。

(1)通过生物信息学对鸟胞内分枝杆菌MmpL11的研究发现，两个标准株中存在MmpL11的同源序列序列，这些同源序列可能在以后的研究中做为药物标靶设计药物达到诊断或治疗结核病的目的。

(2)在确定两个标准株的MmpL11的同源序列的过程中跨膜次数与肽链N端在膜内外的分布情况作为辅助条件进行分析的方法未见报道。

(3)通过生物信息学筛选出一些MmpL11的同源序列，并通过生物信息学分析对其理化性质、二级结构、结构域等进行分析，为下一步对该蛋白功能的研究提供理论支持。

(4)通过生物信息学对MmpL11蛋白进行分析是一种合理的方法，为结核分枝杆菌保守序列和靶位点的研究提供了新的研究思路。

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Sequence analysis and function prediction ofMycobacteriumaviumintracellularemmpL11 gene

WANG Wenjing1, SUN Yan2, WANG Xinqian2, YU Xiaoli2*

(1.TheSecondMiddleSchoolNanyang,Nanyang473000,China;2.SchoolofBiologyandPharmaceuticalEngineering,WuhanPolytechnicUniversity,Wuhan430023,China)

Abstract：To provide evidence for future research on the structures and function of mmpL11(Rv0202c) in Mycobacterium, we analyzed homologous sequences, predicted topological structures and conservative domain structures of two Nontuberculous Mycobacterions named M. Intracellulare and M.avium, both of which were compared with M.Smegmatisstr MC2155 and H37Rv. According to the homologous comparison,we found two standard strains of mmpL11 homologous genes. The physicochemical properties and con-served domain of MmpL11 in M. tuberculosis were predicted by ExPASy online tools. Online tool TMHMM Server 2.0 was used to predicted the topological structure.Interproscan was used to predict conservative domain structure. SSpro was used to predict the secondary structure． According to the physical and chemical properties of protein, the amino acid number of OCU48920 was 1 018, molecular weight was 108.4 kD, theoretical isoelectric point was 7.61,hydrophobic index was 0.227, the amino acid number of MAP3637c was 1 007, the molecular weight was 107.2 kD, theoretical isoelectric point was 8.59, hydrophobic index was 0.231,the amino acid number of MSMEG0241 was 954, the molecular weight was 102.6 kD, theoretical isoelectric point was 5.98 and hydrophobic index was 0.305.By SignalP’s predicting,we found MmpL11 didn’t have signal peptide cutting locus in its three standard strains and signal peptide.The forecast of transmembrane showed that it crossed membrane 12 times and 12 peptides.N-terminal was within the membrane.Secondary structure was given priority to with alpha helix and beta patches.The prediction of conservative sequence and MmpL11 protein’s function showed two MMPL transmembrane domain (MMPL domain) structure, a sterol sensitive polypeptide area (SSD domain). OCU48920, MAP3637c were homologous proteins of H37Rv MmpL11.We speculate that their functions were similar with MmpL11, and they were transcators of mycolic-acid.These two proteins participated in transporting intracellular small molecules and signal transduction.

Keywords：Nontuberculous Mycobacterion；MmpL11 ；Sequential analysis;Function prediction

中图分类号：Q 93

文献标志码：A

文章编号：1672-5565(2016)01-007-06

doi:10.3969/j.issn.1672-5565.2016.01.02

作者简介：王文靖，女，研究方向：微生物；E-mail：2504692896@qq.com.*通信作者：余晓丽，女，教授，研究方向：细胞生物学；E-mail：yxll268@126.com.

基金项目：武汉轻工大学研究生创新基金项目(2014cx019)。

收稿日期：2015-11-12；修回日期：2015-12-15.