LKB1对胰腺癌细胞迁移侵袭及上皮间质转化的影响及机制研究

张志强　王梓瑛　王晓舟　郑　爽　马　怡　赫丽杰

110016 辽宁省人民医院



LKB1对胰腺癌细胞迁移侵袭及上皮间质转化的影响及机制研究

张志强王梓瑛王晓舟郑爽马怡赫丽杰

110016 辽宁省人民医院

【摘要】目的研究LKB1基因对人胰腺癌细胞迁移侵袭及上皮间质转化的影响及机制。方法将LKB1过表达质粒转染至人胰腺癌细胞ASPC-1，实验分为转染试剂组、空载体组和LKB1过表达组。Western blot检测细胞转染后LKB1蛋白的表达水平；划痕实验和Transwell实验分别检测LKB1过表达对人胰腺癌细胞ASPC-1迁移、侵袭能力的影响；Western blot检测LKB1过表达对AMPKα、p-AMPKα及上皮间质转化相关蛋白E-钙黏蛋白(E-cadherin)、N-钙黏蛋白(N-cadherin)、波形蛋白(Vimentin)表达的影响。结果与转染试剂组相比，LKB1过表达质粒转染人胰腺癌细胞ASPC-1后LKB1蛋白表达水平明显增高(P<0.01)，细胞迁移、侵袭能力均显著降低(P<0.01)，p-AMPKα及上皮细胞标志物E-cadherin的蛋白相对表达水平增高(P<0.01)，间质表型细胞标志物N-cadherin和Vimentin蛋白相对表达水平显著下降(P<0.01)。结论LKB1抑制人胰腺癌细胞ASPC-1的迁移、侵袭和上皮间质转化，该抑制过程可能通过激活AMPK信号通路发挥作用。

【关键词】LKB1；胰腺癌；迁移；侵袭；上皮间质转化

(ThePracticalJournalofCancer,2016,31:362～365)

胰腺癌是恶性程度极高的消化道肿瘤之一，由于生长速度快、转移率高、预后差等原因往往被称为“癌中之王”。近年来，外科已经可以切除15%～20%的患者，即使这样，胰腺癌术后中位生存时间仅为8～12个月，晚期胰腺癌的中位生存期仅为3～6个月，浸润和转移是胰腺癌致死的主要原因[1-2]。我国胰腺癌发病率为5.19/10万，且呈逐年上升趋势，死亡率为4.39/10万，虽低于世界平均水平，但5年生存率仅为4%[3]。近十年来针对胰腺癌的治疗尚无突破性进展，进一步研究胰腺癌侵袭转移的分子机制对胰腺癌的早期诊断、治疗及预后改善具有重要意义。

基础研究显示上皮间质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)是肿瘤侵袭转移的重要过程[4]，研究显示EMT的发生受多种因素调控。LKB1是1个抑癌基因，对细胞增殖、能量代谢等具有调控作用。既往研究显示LKB1在胰腺癌中存在基因缺失[5]，LKB1的过表达可促进胰腺癌细胞凋亡[6]，但LKB1对胰腺癌侵袭转移及EMT的影响尚不明确，本研究以人转移胰腺癌细胞ASPC-1为研究对象，探讨LKB1过表达对胰腺癌细胞迁移侵袭能力和EMT的影响及作用机制。

1材料与方法

1.1实验材料

人胰腺癌细胞ASPC-1(中国科学院上海细胞库)，真核表达载体pcDNA3.1、真核重组质粒pcDNA3.1-LKB1(沈阳万类)，DMEM培养基(美国Gibco)，胎牛血清(美国Hyclone)，lipofectamine 2000转染试剂(美国Invitrogen)，Transwell小室(美国Corning)，Matrigel基质胶(美国BD公司)，结晶紫(美国Amresco)，RIPA裂解液(上海碧云天)，LKB1抗体、AMPKα抗体、p-AMPKα抗体、HRP标记二抗(英国Abcam)，E-cadherin抗体、N-cadherin抗体、Vimentin抗体、内参-actin抗体、ECL化学发光底物(沈阳万类)。

1.2方法

1.2.1细胞转染以5×105个/孔的密度将人胰腺癌细胞ASPC-1接种于6孔培养板，置于37 ℃，5% CO2的饱和湿度培养箱内培养。待细胞生长至80%融合时，按照Lipofectamine 2000转染试剂说明书操作，LKB1过表达组和空载体组细胞分别转染pcDNA3.1-LKB1和pcDNA3.1，对照组加入等量转染试剂。转染后48 h采用Western blot检测各组细胞中LKB1的表达水平。

1.2.2划痕实验检测细胞迁移能力转染后24 h进行划痕实验，用200 μl微量移液器的吸管垂直于细胞表面均匀划线，无血清培养液洗涤细胞两次，除去细胞碎片，显微镜下观察并按组拍照。换用无血清培养基继续培养，将各组细胞置于37 ℃、5% CO2的饱和湿度培养箱中培养24 h并记录，计算各组细胞迁移率。

1.2.3Transwell实验检测细胞侵袭能力转染后24 h收集各组细胞，将细胞稀释成1×105个/ml的细胞悬液，取200 μl接种于包被好Matrigel胶的Transwell小室的上室。下室中加入800 μl含20%胎牛血清的DMEM培养液，置于细胞培养箱中培养24 h。用棉签擦去微孔滤膜上层的胶，加入多聚甲醛固定20 min，结晶紫染色5 min。于200×倒置显微镜下随机选取5个视野计数侵袭细胞，取平均数。

1.2.4Western blot检测细胞中蛋白表达水平转染后48 h收集各组细胞，加入RIPA细胞裂解液，提取细胞总蛋白，BCA法测蛋白浓度，用5×上样缓冲液混合蛋白后沸水浴中煮10 min，加热变性后进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，半干电转至PVDF膜，5%脱脂牛奶进行封闭1 h，加入1∶1 000倍稀释的抗人LKB1抗体、AMPKα抗体、p-AMPKα抗体、E-cadherin抗体、N-cadherin抗体、Vimentin抗体，4 ℃孵育过夜后再加入1∶5 000倍稀释的辣根过氧化物酶标记二抗，37 ℃孵育1 h，加入ECL化学发光底物曝光显色，扫描胶片，凝胶图像处理系统分析目的条带的光密度值，以β-actin为内参进行标化处理。

1.3统计学处理

应用IBM SPSS 19.0进行单因素方差分析，所有实验数据以均数±标准差表示，采用t检验分析组间差异，P<0.05表示差异有统计学意义。

2结果

2.1转染LKB1过表达质粒对人胰腺癌细胞ASPC-1中LKB1蛋白表达的影响

Western blot检测各组细胞中LKB1蛋白表达水平，检测结果如图1所示，与转染试剂组相比，空载体组LKB1蛋白相对表达水平无显著变化，LKB1过表达组LKB1蛋白相对表达水平显著升高(P<0.01)。

A为转染试剂组；B为空载体组；C为LKB1过表达组。

2.2LKB1过表达对人胰腺癌细胞ASPC-1迁移能力的影响

细胞划痕实验检测LKB1过表达对人胰腺癌细胞ASPC-1迁移能力的影响，结果如图2所示，与转染试剂组(46.01±5.23)相比，空载体组(44.08±3.92)细胞迁移能力无明显变化，LKB1过表达组(23.48±3.18)细胞迁移能力明显下降(P<0.01)，提示LKB1过表达对人胰腺癌细胞ASPC-1体外迁移能力具有抑制作用。

A为转染试剂组；B为空载体组；C为LKB1过表达组。

2.3LKB1过表达对人胰腺癌细胞ASPC-1侵袭能力的影响

Transwell实验检测LKB1过表达对人胰腺癌细胞ASPC-1侵袭能力的影响，检测结果如图3所示，与转染试剂组(112.39±10.89)相比，空载体组(107.99±10.99)细胞侵袭能力无明显变化，LKB1过表达组(57.89±7.89)细胞侵袭能力明显降低(P<0.01)，表明LKB1过表达对人胰腺癌细胞ASPC-1侵袭能力具有抑制作用。

A为转染试剂组；B为空载体组；C为LKB1过表达组。

2.4LKB1过表达对人胰腺癌细胞ASPC-1上皮间质转化的影响

Western blot检测LKB1过表达对人胰腺癌细胞ASPC-1上皮间质转化相关蛋白E-cadherin、N-cadherin及Vimentin表达水平的影响，检测结果如图4所示，与转染试剂组相比，空载体转染组各指标无明显变化，LKB1过表达组上皮细胞标志物E-cadherin蛋白相对表达水平明显升高(P<0.01)，间质表型细胞标志物N-cadherin及Vimentin的蛋白相对表达水平明显降低(P<0.01)，提示LKB1过表达对人胰腺癌细胞ASPC-1上皮间质转化具有明显抑制作用。

A为转染试剂组；B为空载体组；C为LKB1过表达组。

2.5LKB1过表达对人胰腺癌细胞ASPC-1中AMPK信号通路的影响

Western blot检测LKB1过表达对人胰腺癌细胞ASPC-1中AMPK信号通路相关蛋白AMPKα及p-AMPKα表达水平的影响，检测结果如图5所示，与转染试剂组相比，空载体组AMPKα和p-AMPKα的蛋白表达水平均无显著变化，LKB1过表达组AMPKα表达水平较转染试剂组无明显变化，p-AMPKα蛋白相对表达水平明显升高(P<0.01)，提示在人胰腺癌细胞ASPC-1中过表达LKB1可磷酸化激活AMPKα。

3讨论

胰腺癌大多数起源于腺管上皮的导管腺癌，早期无明显症状和体征，缺乏有效的早期筛查和诊断方法，80%以上患者就诊时已处于局部晚期或晚期，手术切除机会仅有15%～20%[7]。晚期胰腺癌的中位生存期仅为3～6个月，局部晚期者术后中位时间也仅为8～12个月。既往研究发现胰腺癌组织中存在多个基因表达异常，其中LKB1(liver kinase B1)在胰腺癌组织中存在表达缺失或下降[5,8-9]，但其具体作用机制尚未明确。

A为转染试剂组；B为空载体组；C为LKB1过表达组。

LKB1又称STK11(serine-threonine kinase 11,STK11)，定位于人染色体19p13.3，编码进化保守的丝氨酸/苏氨酸激酶，可磷酸化激活AMPK及12种AMPK相关激酶[10]。研究发现在LKB1缺失的肿瘤细胞中导入LKB1可引起p53依赖的激酶抑制因子p21表达升高，使细胞周期停滞于G1期。LKB1缺失或下调则伴随着p21表达下降，促进肿瘤细胞增殖[11]。在LKB1表达缺失的乳腺癌细胞中导入LKB1可抑制细胞迁移和侵袭，减少肿瘤细胞向肺部转移[12]。Hezel等研究发现LKB1基因缺失可引发小鼠浆液性囊腺瘤，破坏腺泡细胞结构完整性，使细胞失去极性，同时伴随腺泡导管上皮化生[13]。本研究结果显示LKB1过表达可引起人胰腺癌细胞ASPC-1迁移侵袭能力下降，提示LKB1具有潜在抑制胰腺癌细胞侵袭转移的能力。

既往的研究证实上皮间质转化(epithelial-mesenchymal transitions，EMT)是肿瘤侵袭转移的重要因素之一[14]。EMT是指上皮细胞在特定的生理和病理情况下向间质细胞转分化的现象。自然状态下，上皮细胞排列紧密，细胞间质少，具有高度的极性，间质细胞结构松散，缺乏细胞连接和细胞极性。EMT发生后细胞黏附性降低，运动能力增强，迁移和侵袭能力增加，EMT的特征性表现是上皮细胞标志物E-cadherin降低，间质表型细胞标志物N-cadherin、Vimentin表达增加[15]。本实验结果显示LKB1过表达可显著增加人胰腺癌细胞ASPC-1中E-cadherin蛋白相对表达量，降低N-cadherin和Vimentin的蛋白表达水平，表明LKB1在一定程度上抑制人胰腺癌细胞EMT的发生，可能通过该作用抑制胰腺癌浸润和远端转移。

腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)是LKB1的1种重要底物，它是真核细胞在ATP水平较低的情况下存在的1种主要的细胞应激因子，由α、和γ亚基组成的异源三聚体。α-亚基N-末端包含一个保守的Ser/Thr激酶区，其中苏氨酸(Thr-172)位点的磷酸化是其激酶活性所必需的[16]。LKB1可以在体外直接磷酸化AMPK的Thr-172从而活化AMPK，在LKB1缺乏的小鼠胚胎中几乎没有检测到AMPK的Thr-172位点的磷酸化。此外，研究表明AMPK的激活剂可逆转乳腺癌细胞和前列腺癌细胞间质表型，沉默AMPK后逆转作用消失，提示AMPK在肿瘤细胞EMT过程中发挥重要作用[17]。本研究结果显示，LKB1过表达可明显增加人胰腺癌细胞ASPC-1中p-AMPKα的蛋白表达，降低细胞间质表型标记物N-cadherin和Vimentin的表达，提示LKB1可能通过磷酸化激活AMPKα抑制人胰腺癌细胞上皮间质转化，降低细胞迁移侵袭能力，LKB1有可能成为胰腺癌浸润和转移的一个治疗靶点。

参考文献

[1]Siegel R,Naishadham D,Jemal A.Cancer statistics,2012〔J〕.CA Cancer J Clin,2012,62(1):10-29.

[2]Vincent A,Herman J,Schulick R,et al.Pancreatic cancer〔J〕.Lancet,2011,378(9791):607-620.

[3]李慧超,郑荣寿,张思维,等.中国2010年胰腺癌发病和死亡分析〔J〕.中国肿瘤,2015,24(3):163-169.

[4]Bonnomet A,Brysse A,Tachsidis A,et al.Epithelial-to-me-

senchymal transitions and circulating tumor cells〔J〕.J Mammary Gland Biol Neoplasia,2010,15(2):261-273.

[5]Sahin F,Maitra A,Argani P,et al.Loss of Stk11/Lkb1 expression in pancreatic and biliary neoplasms〔J〕.Mod Pathol,2003,16(7):686-691.

[6]Qanungo S,Haldar S,Basu A.Restoration of silenced Peutz-Jeghers syndrome gene,LKB1,induces apoptosis in pancreatic carcinoma cells〔J〕.Neoplasia,2003,5(4):367-374.

[7]Hidalgo M.Pancreatic cancer〔J〕.N Engl J Med,2010,362(17):1605-1617.

[8]De Wilde RF,Ottenhof NA,Jansen M,et al.Analysis of LKB1 mutations and other molecular alterations in pancreatic acinar cell carcinoma〔J〕.Mod Pathol,2011,24(9):1229-1236.

[9]Morton JP,Jamieson NB,Karim SA,et al.LKB1 haploinsufficiency cooperates with Kras to promote pancreatic cancer through suppression of p21-dependent growth arrest〔J〕.Gastroenterology,2010,139(2):586-597.

[10]Gan RY,Li HB.Recent progress on liver kinase B1(LKB-

1): expression,regulation,downstream signaling and cancer suppressive function〔J〕.Int J Mol Sci,2014,15(9):16698-16718.

[11]Tiainen M,Vaahtomeri K,Ylikorkala A,et al.Growth arrest by the LKB1 tumor suppressor: induction of p21(WAF1/CIP1)〔J〕.Hum Mol Genet,2002,11(13):1497-1504.

[12]Zhuang ZG,Di GH,Shen ZZ,et al.Enhanced expression of LKB1 in breast cancer cells attenuates angiogenesis,invasion,and metastatic potential〔J〕.Mol Cancer Res,2006,4(11):843-849.

[13]Hezel AF,Gurumurthy S,Granot Z,et al.Pancreatic LKB1 deletion leads to acinar polarity defects and cystic neoplasms〔J〕.Mol Cell Biol,2008,28(7):2414-2425.

[14]Thiery JP.Epithelial-mesenchymal transitions in developm-

ent and pathologies〔J〕.Curr Opin Cell Biol,2003,15(6):740-746.

[15]Thiery JP,Acloque H,Huang RY,et al.Epithelial-mesenchymal transitions in development and disease〔J〕.Cell,2009,139(5):871-890.

[16]Sarnowska E,Balcerak A,Olszyna-Serementa M,et al.AM-

P-activated protein kinase(AMPK) as therapeutic target〔J〕.Postepy Hig Med Dosw(Online),2013,67:750-760.

[17]Chou CC,Lee KH,Lai IL,et al.AMPK reverses the mesenchymal phenotype of cancer cells by targeting the Akt-MDM2-Foxo3a signaling axis〔J〕.Cancer Res,2014,74(17):4783-4795.

(编辑：吴小红)

Effects of LKB1 on Migration,Invasion and Epithelial-Mesenchymal Transition in Pancreatic Carcinoma Cells

ZHANGZhiqiang,WANGZiying,WANGXiaozhou,etal.

LiaoningProvincialPeople′sHospital,Shenyang,110016

【Abstract】ObjectiveTo investigate the effects and mechanism of LKB1 on migration,invasion and epithelial-mesenchymal transition in human pancreatic carcinoma cells.MethodsHuman pancreatic carcinoma ASPC-1 cells were transfected with pcDNA3.1-LKB1.The experiment was divided into Mock,Vector and Vector-LKB1 group.The protein expression level of LKB1 was validated by Western blot.Cell migration and invasion ability was determined by the scratch tests and Transwell assay.The protein expression level of AMPKα,p-AMPKα and epithelial-mesenchymal transition(EMT)-related markers(E-cadherin,N-cadherin and Vimentin) were assayed by Western blot analysis.ResultsThe protein expression level of LKB1 was significantly increased in Vector-LKB1 group compared with the Mock group(P<0.01),and the ability of cell migration and invasion was strongly reduced(P<0.01).Increased expression of p-AMPKα,epithelial marker(E-cadherin) and decreased expression of mesenchymal markers(N-cadherin,Vimentin) were observed in Vector-LKB1 group compared with the Mock group(P<0.01).ConclusionLKB1 inhibit migration,invasion ability and epithelial-mesenchymal transition of human pancreatic carcinoma ASPC-1 cells,which may act through activating AMPK signaling pathway.

【Key words】LKB1;Pancreatic carcinoma;Migration;Invasion;Epithelial-mesenchymal transition

(收稿日期2015-08-24修回日期 2016-01-20)

中图分类号：R735.9

文献标识码：A

文章编号：1001-5930(2016)03-0362-04

DOI：10.3969/j.issn.1001-5930.2016.03.005

通讯作者：赫丽杰