高效液相色谱-串联质谱法测定白酒中6种甜味剂

梅　婕，司冠儒，张温清，唐　莹，周　萍(1.安徽宣酒集团股份有限公司科研中心，安徽宣城242000；2.江南小窖酿造工艺研究所，安徽宣城242000)



高效液相色谱-串联质谱法测定白酒中6种甜味剂

梅婕1，2，司冠儒1，2，张温清1，2，唐莹1，2，周萍1，2
(1.安徽宣酒集团股份有限公司科研中心，安徽宣城242000；2.江南小窖酿造工艺研究所，安徽宣城242000)

摘要：建立了白酒中安赛蜜、糖精钠、甜蜜素、三氯蔗糖、阿斯巴甜和纽甜6种甜味剂的高效液相色谱-串联质谱(HPLC-MS/MS)分析方法。白酒样品经微孔滤膜过滤后，以乙腈和含0.1 %甲酸的水溶液为流动相，在ZORBAX Eclipse Plus C18色谱柱上进行分离，以电喷雾多反应监测(MRM)模式进行质谱分析。研究结果表明，6种甜味剂在检测范围内均具有良好的线性关系(R2＞0.997)；方法的检出限LOD (S/N=3)分别为0.36 μg/L、1.30 μg/L、0.54 μg/L、4.08 μg/L、0.15 μg/L和0.003 μg/L，定量限LOQ (S/N=10)分别为1.21 μg/L、4.34 μg/L、1.80 μg/L、13.61 μg/L、0.49 μg/L和0.01 μg/L；样品的回收率分别为95.2 %～97.5 %、95.4 %～98.7 %、97.0 %～97.8 %、98.3 %～100.7 %、96.1 %～99.9 %和93.4 %～98.6 %；相对标准偏差分别为0.83～3.34、1.80～3.42、1.17～3.14、0.70～3.10、0.29～1.10 和0.25～3.30。该分析方法前处理简单、灵敏度高、重现性好、分析速度快，可用于白酒中甜味剂的检测。

关键词：高效液相色谱-串联质谱；白酒；甜味剂

甜味剂是食品行业中常用的添加剂。近几年来的相关研究表明，甜蜜素、糖精钠等甜味剂具有损害肝脏及致癌等副作用。国家标准GB/T 10781.1—2006中明确规定，发酵型白酒中不得加入非自身发酵产生的呈香呈味物质。然而，在酿酒行业中，为了掩盖酒体苦涩，提高醇厚感和绵甜感，仍有一些不法企业在白酒的生产和勾调过程中违规添加甜味剂。因此，开发一种快速、灵敏、准确的甜味剂检测方法对于规范白酒企业行为以及保障消费者的安全十分重要。

传统的甜味剂的检测方法，如液相色谱法[1-2]、气相色谱法[3-4]、紫外分光光度法[5]等灵敏度较低，且容易出现假阳性[6]。随着仪器及检测分析手段的进步，液相色谱-质谱法[7-9]已用于甜味剂的检测。但针对白酒中甜味剂的检测，仍然存在着检测分析速度慢、检测效率低等问题，特别是对于纽甜这种甜度为蔗糖的7000～13000倍的新型甜味剂的检测，需要使用超高效液相-高分辨率质谱[10-12]，检测成本较高。本研究利用高效液相色谱-串联质谱，建立了白酒中6种甜味剂的测定方法。该方法样品预处理简单、分析速度快、检测成本低，适用于白酒中甜味剂的常规检测。

1　材料与方法

1.1材料、试剂及仪器

样品：1#、2#和3#白酒样品分别为三星宣酒(40 %vol)、宣酒(40 %vol)和中国宣酒(53 %vol)。

试剂：安赛蜜标准品(纯度≥99.2 %)、糖精钠标准品(纯度≥99.0 %)、甜蜜素标准品(纯度≥99.0 %)、三氯蔗糖标准品(纯度≥99.0 %)、阿斯巴甜标准品(纯度≥99.0 %)、纽甜标准品(纯度≥99.0 %)皆购自Dr. Ehrenstorfer(德国)标准品公司；甲酸(色谱纯)、乙腈(色谱纯)购自上海安谱科学仪器有限公司；实验用水由实验室专用纯水机制备；白酒样品为本公司产品。

仪器设备：安捷伦高效液相色谱-串联质谱(1260-G6460)，安捷伦ZORBAX Eclipse Plus C18色谱柱；超纯水仪A2S-10-CE；电子天平；超声波清洗仪。

1.2标准曲线的建立

准确称取安赛蜜、糖精钠、甜蜜素、三氯蔗糖、阿斯巴甜和纽甜标准品各0.1 g(精确到0.0001 g)，分别将其置于100 mL容量瓶中，加超纯水定容，分别制成浓度为1000 mg/L的标准溶液；分别移取标准溶液1 mL于100 mL容量瓶中，用超纯水定容至刻度，制成浓度为10 mg/L的混合标准溶液，再取混合标准溶液分别稀释成浓度为0.1 mg/L、0.2 mg/L、0.4 mg/L、0.6 mg/L、0.8 mg/L 和1.0 mg/L系列标准溶液。在选定的色谱和质谱条件下测定，以浓度为横坐标、峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。

1.3色谱条件

甜味剂测定的色谱条件见表1。

表1　6种甜味剂测定的色谱条件

1.4质谱条件

电喷雾ESI源，干燥气温度：350℃，干燥气流速：11 L/min，毛细管电压：4000 V(+)/3500 V(-)，雾化器压力：50 psi。

1.5样品处理

取酒样直接用0.22 μm的有机滤膜过滤，进行质谱分析。

2　结果与讨论

2.1色谱分离条件的优化

相关研究表明[8-12]，甜蜜素、三氯蔗糖、阿斯巴甜和纽甜在以甲醇和水为流动相进行洗脱时分离效果较好。本实验以甲醇和水为流动相时，糖精钠和甜蜜素虽然可以分离，但峰型较差；提高甲醇浓度又会影响二者的分离，故选用极性稍弱的乙腈进行洗脱。综合考虑灵敏度和分离度两项指标，最终确定甜蜜素、三氯蔗糖、阿斯巴甜和纽甜的流动相为乙腈∶水(含0.1 %甲酸)=18∶82；阿斯巴甜标和纽甜的流动相为乙腈∶水(含0.1 %甲酸)=40∶60；流速均为0.4 mL/min。

2.2质谱检测条件的优化

本实验采用多反应监测模式(MRM)测定白酒中的6种甜味剂。首先采用Scan模式，确认化合物离子的质量数；然后采用SIM模式，优化毛细管出口电压，保证母离子的传输效率；接着在Product Ion(子离子)模式下扫描，选择定量离子，优化碰撞能，得到最佳的子离子用于定量；最后在MRM模式下，使用已经优化好的毛细管出口电压和碰撞能进行甜味剂测定。优化后的MRM条件见表2。

表2　MRM模式下6种甜味剂的检测条件

2.3线性关系及标准曲线

在优化后的色谱和质谱条件下测定上述系列标准溶液。分别以6种甜味剂定量离子的色谱峰面积为纵坐标，样品浓度为横坐标绘制标准曲线，各组分的线性方程、相关系数线性范围见表3。以MRM色谱峰的信噪比S/N=3确定方法检出限(LOD)，安赛蜜、糖精钠、甜蜜素、三氯蔗糖、阿斯巴甜和纽甜的检出限分别为0.36 μg/L、1.30 μg/L、0.54 μg/L、4.08 μg/L、0.15 μg/L和0.003 μg/L；以色谱峰的信噪比S/N=10确定定量限(LOQ)，定量限分别为1.21 μg/L、4.34 μg/L、1.80 μg/L、13.61 μg/L、0.49 μg/L 和0.01 μg/L。

2.4精密度及回收率验证

表3　6种甜味剂的标准曲线线性范围及相关系数

准确量取300 μL、500 μL和700 μL浓度为10 mg/L的混合标准溶液，用酒样定容至10 mL，配制成终浓度为0.3 mg/L、0.5 mg/L和0.7 mg/L的加标溶液。按照1.5所述方法处理样品，然后进行质谱分析，结果见表4。加标样品中安赛蜜、糖精钠、甜蜜素、三氯蔗糖、阿斯巴甜和纽甜的回收率分别为95.2 %～97.5 %、95.4 %～98.7 %、97.0 %～97.8 %、98.3 %～100.7 %、96.1 %～99.9 %和93.4 %～98.6 %；RSD分别为0.83～3.34、1.80～3.42、1.17～3.14、0.70～3.10、0.29～1.10和0.25～3.30。由此表明，该方法具有较高的精密度和回收率，可用于常规检测。

表4　6种甜味剂的相对标准偏差及回收率

2.5样品测定

在建立的HPLC-MS/MS条件下，对本公司的1#、2# 和3#酒样进行测定，结果见表5。酒样中6种甜味剂均未检出，所测结果符合国家标准对蒸馏酒中甜味剂含量的要求。

表5　酒样中6种甜味剂的检测结果

3　结论

本研究通过优化色谱和质谱条件，建立了白酒中的安赛蜜、糖精钠、甜蜜素、三氯蔗糖、阿斯巴甜和纽甜的分析方法。该方法简单、快速，精密度和精确性良好，样品前处理简单，可用于白酒厂甜味剂的日常检测。

参考文献：

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遵义市酒业协会正式成立

本刊讯：2015年12月5日，经遵义市民政局批复，遵义市酒业协会正式成立。（小雨）

Determination of Six Kinds of Sweeteners in Liquor by HPLC-MS

MEI Jie1,2, SI Guanru1,2, ZHANG Wenqing1,2, TANG Ying1,2and ZHOU Ping1,2
(1. Xuanjiu Group Co.Ltd., Xuancheng,Anhui 242000; 2. Jiangnan Institute of Small Pit Brewing Technology, Xuancheng,Anhui 242000, China)

Abstract:A rapid and accurate analytic method based on HPLC-MS/MS had been developed for the determination of six kinds of sweeteners in liquor, including acesulfame potassium, saccharin sodium, sodium cyclamate, sucralose, aspartame and neotame. Liquor samples underwent microporous membrane filtration, then separated on a ZORBAX Eclipse Plus C18 column with acetonitrile and 0.1% formic acid aqueous solution as the mobile phase, and then electrospray ionization was applied and operated in the multiple reaction monitoring (MRM) mode. The results showed that, the correlation curves of six sweeteners showed good linearity (R2＞0.997), the limits of detection (LOD, S/N=3) were 0.36 μg/L, 1.30 μg/L, 0.54 μg/L, 4.08 μg/L, 0.15 μg/L and 0.003 μg/L, respectively; the limits of quantitation (LOQ, S/N=10) were 1.21 μg/L, 4.34 μg/L, 1.80 μg/L, 13.61 μg/L, 0.49 μg/L and 0.01 μg/L, respectively; and the recoveries were 95.2 %～97.5 %, 95.4 %～98.7 %, 97.0 %～97.8 %, 98.3 %～100.7 %, 96.1 %～99.9 % and 93.4 %～98.6 %, respectively; the relative standard deviations (RSD) were 0.83～3.34, 1.80～3.42, 1.17～3.14, 0.70～3.10, 0.29～1.10 and 0.25～3.30, respectively. The method was sensitive and reproducible with a simple pretreatment and rapid analysis speed, which could be applied to detect sweeteners in liquor.

Key words:HPLC-MS/MS; Baijiu; sweetener

通讯作者：周萍，女，工程师，高级检验师，省白酒评委，安徽宣酒集团食品安全总监。

作者简介：梅婕，女，硕士研究生，主要从事酿酒微生物和白酒风味物质研究，发表论文多篇；司冠儒，男，硕士研究生，主要从事酿酒微生物和白酒风味物质研究，发表论文多篇，申请专利多项。

收稿日期：2015-12-09

DOI：10.13746/j.njkj.2015460

中图分类号：TS262.3；TS261.7

文献标识码：A

文章编号：1001-9286（2016）03-0122-03

优先数字出版时间：2016-01-28；地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/52.1051.TS.20160128.1454.005.html。