HPLC-DAD结合二阶校正方法用于葡萄酒中L-苹果酸的测定分析

欧阳立群，戴　明，胡朝阳，王　征，林　钦，周　鹏，赵　峰(福建省产品质量检验研究院,国家加工食品质量监督检验中心，福建福州350002)



HPLC-DAD结合二阶校正方法用于葡萄酒中L-苹果酸的测定分析

欧阳立群，戴明，胡朝阳，王征，林钦，周鹏，赵峰
(福建省产品质量检验研究院,国家加工食品质量监督检验中心，福建福州350002)

摘要：利用基于交替三线性分解(ATLD)的二阶校正方法与HPLC-DAD结合，定量分析葡萄酒中的L-苹果酸。虽然L-苹果酸与样品中未知干扰物存在色谱峰重叠，但利用化学计量学方法中具有“二阶优势”的二阶校正方法分析HPLC-DAD检测数据，获得了葡萄酒中L-苹果酸满意的定性定量结果。

关键词：二阶校正；交替三线性分解（ATLD）；HPLC-DAD；葡萄酒；L-苹果酸

随着现代分析仪器的发展，样本多维检测数据的获得变得越来越容易，这些多维数据包含了样本较多的信息量，可以借助合适的化学计量学方法从中提取有用信息用于样本的分析。化学计量学中的二阶校正法处理的是三维数据阵，如今能提供三维分析数据的仪器越来越多，二阶校正方法[1-3]因此得到了广泛的应用，为复杂体系中目标组分的定性定量分析提供了一种有效的数据分析手段。目前能提供三维数据的仪器有液相色谱带二极管阵列检测器、二维气相色谱、二维液相色谱、液相色谱-质谱联用仪、气相色谱-质谱联用仪、液气相色谱-红外联用仪、毛细管电泳-质谱联用仪、二维核磁共振仪以及激发发射荧光仪等，其中二阶校正结合激发发射荧光仪和HPLC-DAD方法目前应用较为广泛[4-6]。

葡萄酒的成分基本来自于葡萄，现已知有600余种成分[7]，其中含有包括苹果酸在内的多种有机酸。在葡萄酒的加工工艺中，利用乳酸菌将苹果酸变成乳酸，并释放出CO2，从而起到降低酸度、改善口感和香气、提高细菌稳定性的作用[8]。现有文献报道检测葡萄酒中苹果酸的检测方法主要为高效液相色谱法[9-10]，国家标准检测方法(GB/T 5009.157—2003食品中有机酸的测定)同样为高效液相色谱法。实际中，要准确预测存在大量未知干扰的复杂体系中的感兴趣组分的浓度有时是十分困难的，而二阶校正方法具有在存在未知干扰物情况下，依然能够对多个感兴趣组分进行定性定量分析的优势即所谓的“二阶优势”。本研究利用二阶校正方法解析葡萄酒样本的HPLC-DAD检测数据，在有干扰存在下对目标组分的色谱和光谱进行准确分辨，从而实现对目标组分的定性定量分析。

1　材料与方法

1.1材料、试剂及仪器

样品及处理：取某厂生产葡萄酒，称取5 g样品于10 mL具塞比色管内，用0.05 %磷酸溶液定容至刻度，涡旋混匀1 min，过0.45µm水相滤膜，仪器进样分析。

仪器及试剂：Waters 2695高效液相色谱(Waters, USA)；涡旋混合器（江苏健康医药公司）；磷酸(色谱纯，科密欧试剂)；L-苹果酸标准品(北京振翔公司)；所用水均为Milli-Q超纯水系统制备的超纯水。ATLD方法[11]。MATLAB软件。L-苹果酸标准品：用0.05 %磷酸溶液配制成1.0 mg/mL储备液，置于冰箱4℃保存，使用时用0.05 %磷酸溶液稀释。

1.2色谱条件

色谱柱：XB-C18（150 mm×4.6 mm，5 μm）；柱温：35℃；流速：1.0 mL/min；流动相：0.05 %磷酸溶液；检测器：二极管阵列（DAD）；检测波长扫描范围：200.0～400.0 nm；进样量：10.0 μL。

2　结果与讨论

2.1数据分析

图1　L-苹果酸标准品(A1)和葡萄酒样品(A2) 205 nm波长色谱图

图1中A1和A2分别表示L-苹果酸标准品和葡萄酒样品在205 nm波长处的色谱图。由图1可以看出，样品中目标物色谱峰处存在其他杂质色谱峰的干扰。在本实验中，研究利用化学计量学中二阶校正方法在有干扰存在下准确分辨目标物的色谱和光谱峰，进行定量分析。首先应选择有用的数据进行分析，本实验的目标分析物是L-苹果酸，只需提取与其相关的数据进行分析即可。图2为L-苹果酸标准品的光谱图。根据色谱和光谱图，在本实验中，每个样品选择波长范围为200～300 nm，保留时间范围为2.60～3.20 min之间的色谱检测数据作为研究对象，每个样品由此可得到1个维数为361×83（保留时间数据点数×波长数据点数）的量测矩阵。

图2　L-苹果酸标准品光谱图

2.2样品分析

对于复杂的分析样品体系，其真实的组分数是未知的。图3中A1、A2、A3分别表示组分数(n)为2、3、4时样品的ATLD算法分辨色谱图，由图3可以看出，当n≥3时，算法分辨的谱图基本趋于一致，而且组分数设定过多，将会影响算法的运行速度，因此，将组分数设定为3。算法分辨样品的光谱图见图3中A4，图3中实线表示目标分析物L-苹果酸，点线和虚线表示是其他的背景和杂质干扰。

图3　组分数(n)的选择(A1～A3)和算法分辨的光谱图(A4)

利用ATLD对样本检测数据进行解析处理。表1列出了加标样品S1～S6中L-苹果酸的ATLD算法解析结果，S1～S3是空白黄酒样品加标，S4～S6是实际葡萄酒样品加标，每份样品平行6次测定。结果表明，空白加标样品回收率为95.5 %～107.0 %，实际样品加标回收率为95.3 %～96.7 %，结果令人满意。

2.3方法的线性范围及定量限

对本实验方法的线性范围、线性相关系数及定量限(S/N=10)进行分析计算，结果见表2。

3　结论

本研究利用HPLC-DAD与基于ATLD算法的二阶校正方法，定量分析葡萄酒样品中的L-苹果酸。该方法借助ATLD算法对HPLC-DAD测定的葡萄酒样品所组成的三维数据阵进行三线性分解，尽管目标分析物L-苹果酸与体系中干扰物的色谱峰存在重叠，但本方法结合二阶校正方法仍能给出准确的分辨色谱、光谱以及预测浓度，结果表明具有“二阶优势”的二阶校正方法在复杂色谱体系定量分析中能发挥其独特分离优势。

表1　加标样品S1～S6的ATLD解析结果

表2　方法的线性范围、线性相关系数及定量限

参考文献：

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[3] Faber K, Lorber A, Kowalski B R. Generalized rank

annihilation method: Standard errors in the estimated eigenvalues if the instrumental errors are heteroscedastic and correlated[J]. Journal of Chemometrics, 1997, 11(2)：95-109.

[4]杜亚辉,胡乐乾,周丹.高效液相色谱结合二阶校正方法分析水中氨基甲酸酯类农药残留[J].井岗山大学学报：自然版, 2013, 34(1)：47-51.

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[6] Yin X L, Wu H L, Gu H W, et al. Chemometrics-enhanced high performance liquid chromatography-diode array detection strategy for simultaneous determination of eight co-eluted compounds in ten kinds of Chinese teas using second-order calibration method based on alternating trilinear decomposition algorithm[J].Journal of Chromatography A, 2014,1364：151-162.

[7]陈玉庆.葡萄与葡萄酒的营养成分[J].酿酒, 2004, 31(5)：112-114.

[8]段雪荣,朱虹.优质葡萄酒酿造环节之苹果酸-乳酸发酵[J].中外葡萄与葡萄酒, 2009, 9(152)：46-50.

[9]丁青芝,谷耀光,周艺诗,等.蜂胶葡萄酒中8种有机酸RP-HPLC分析方法的建立[J].食品工业, 2014,35(12)：279-283.

[10]杨东伟,李晓静,王芬,等.高效液相色谱法测定葡萄酒中11种有机酸含量[J].安徽农业科学, 2013, 41(3)：1286-1287.

[11] Wu H L, Shibukawa M, Oguma K.An alternating trilinear decomposition method with application to calibration of HPLC-DAD for simultaneous determination of overlapped chlorinated aromatic hydrocarbous[J]. Journal of Chemometrics, 1998, 12(1)：1-26.

沉痛悼念白酒专家刘洪晃先生

本刊讯：惊悉全国著名白酒专家、国家评委、辽宁省白酒工业协会顾问刘洪晃先生因病于2016年2月20日19时05分在海南三亚逝世，享年79岁。我们对刘洪晃先生逝世表示沉痛哀悼。

刘洪晃先生作为新中国知识分子从南方来到北方辽宁，曾经参加轻工部举办的凌川试点、著名全国的茅台试点，是中国白酒全书分析部分撰写人之一，国家老三届白酒评委，第四、五届白酒评比浓香型白酒评酒组组长。1990—1991年，刘洪晃先生兼任轻工业部浓香型白酒和清香型白酒优质产品评选技术专家组成员，2000届国家级白酒评委考核专家技术组成员，中食协白酒专业协会理事，原辽宁省食品工业研究所副总工、高级工程师，曾任辽宁省食品质量监督检验站，全国食品质量检测站副站长。退休后被聘任为辽宁省食品工业专家组成员，兼任辽宁省白酒工业协会顾问等职。

1980年以来，刘洪晃先生先后参与了辽宁省白酒标准“辽Q637-654-80”“辽Q2376-2384-86”，轻工业部部颁标准“QB 850—83, QB941—84”以及浓香型白酒国家标准“GB 10781.1—89、GB/T 15109—94”，《白酒工业术语国家标准》(GB/T 15109—1994)等的起草和制定工作。

刘洪晃先生主编或参加编写了《中国名优白酒鉴别标准手册》《食品标准大全》《白酒品评技术基本知识（讲义）》《白酒生产技术全书》等书籍，并先后发表了《几种酒曲中游离氨基酸的测定》《试论五大香型白酒的相互关系》《初试阈值测定》《浅谈白酒蒸馏测定》《浅谈建立行业大曲质量标准的看法》等论文，数次获得国家和轻工部以及辽宁省的科技进步奖。

刘洪晃先生一生为辽宁白酒乃至中国白酒事业做出卓越贡献，他毕生孜孜不倦研究白酒技术，治学严谨，技术精湛，平易近人，尤其在分析方面带领辽宁发酵研究所白酒分析进入全国领先行列，他成为全国行业知名专家，得到了行业的尊重，是我们的良师益友。

愿谦逊、敬业、慈祥的刘老一路走好！在天堂，仍有美酒相伴！（萤子、晓文）

Second-order Calibration Coupled with HPLC-DAD for Quantitative Analysis of L-malic Acid in Grape Wine

OUYANG Liqun, DAI Ming, HU Chaoyang, WANG Zheng, LIN Qin, ZHOU Peng and ZHAO Feng
(Fujian Inspection and Research Institute for Product Quality, National Supervision and Inspection Center for Processed Food Quality,Fuzhou, Fujian 350002, China)

Abstract:HPLC-DAD coupled with second-order calibration (based on ATLD) was developed for quantitative analysis of L-malic acid in grape wine. Although there were chromatographic peak overlaps between L-malic acid and unknown interferences, such method had the advantage of second-order which could analyze the three-way HPLC-DAD data from both standard and prediction samples, and satisfactory quantitative and qualitative results could be finally obtained.

Key words:second-order calibration; alternating trilinear decomposition (ATLD); HPLC-DAD; grape wine; L-malic acid

作者简介：欧阳立群(1975-)，男，湖南绥宁人，高级工程师，博士，主要从事食品安全检测，E-mail：oylq1888@126.com。

收稿日期：2015-11-05

基金项目：福建省自然科学基金资助项目(2013J01033)。

DOI：10.13746/j.njkj.2015423

中图分类号：TS262.6；TS261.7

文献标识码：A

文章编号：1001-9286（2016）03-0119-03

优先数字出版时间：2015-12-28；地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/52.1051.TS.20151228.1438.004.html。