新生血管、淋巴管在结直肠癌进展中的作用

张林西　郭　颖　白美玲

(河北北方学院生命科学研究中心，河北　张家口　075000)



新生血管、淋巴管在结直肠癌进展中的作用

张林西郭颖白美玲

(河北北方学院生命科学研究中心，河北张家口075000)

〔摘要〕目的研究血管内皮生长因子(VEGF)、CD105、D2-40在结直肠癌中的表达及三者与结直肠癌患者临床病理因素之间的相关性。方法收集结直肠癌标本99例及30例癌旁正常组织，应用免疫组织化学检测VEGF、CD105、D2-40在以上标本中的表达，分析VEGF、CD105、D2-40的表达与结直肠癌患者临床病理因素的相关性，以及三者协同表达情况。结果VEGF、CD105标记的微血管密度(MVD)值、D2-40标记的微淋巴管密度(LVD)值在癌组织中的表达均显著高于癌旁正常组织(P<0.05)；其表达与是否有淋巴结转移均显著相关(P<0.05)；结直肠癌中VEGF与CD105 、CD105与D2-40的表达均呈显著正相关(P<0.05)。结论VEGF、CD105、D2-40可能在结直肠癌的发生进展过程中发挥重要作用；其高表达对结直肠癌的恶性程度及预后评估有一定的应用价值。

〔关键词〕结直肠癌；免疫组织化学；血管内皮生长因子；微血管密度；微淋巴管密度

研究表明，血管生成和新生淋巴管的形成在肿瘤的浸润转移中起着重要作用〔1,2〕。血管内皮生长因子(VEGF)被认为是肿瘤血管新生最重要的调控因子之一，其在促进肿瘤生成、免疫逃脱、浸润转移及淋巴管的形成中发挥重要作用。CD105在肿瘤血管新生中也发挥重要作用，同时是肿瘤新生血管较好的标记物，标记效果强于CD34、CD31。D2-40是肿瘤淋巴管的特异标记物，不与血管内皮反应，只与新生淋巴管内皮细胞、微小淋巴管内皮细胞反应。本研究采用免疫组织化学方法，检测VEGF在结直肠癌组织中的表达；选用CD105标记微血管密度(MVD)和D2-40标记微淋巴管密度(LVD)，分析在结直肠癌浸润进展过程中，VEGF表达与血管新生、淋巴管新生的关系及与结直肠癌临床病理因素之间的关系，旨在探讨血管新生、淋巴管生成在结直肠癌发生发展中的作用。

1材料与方法

1.1标本收集收集河北北方学院附属第一医院2011年3月至2013年2月期间的结直肠癌标本99例、癌旁正常组织30例，患者术前均未进行任何放疗、化疗等治疗。其中结肠癌40例，直肠癌59例；男53例，女46例；年龄<60岁40例，>60岁59例；组织分化程度：高、中分化腺癌83例，低分化腺癌16例；淋巴结无转移55例，有转移44例。

1.2主要试剂及方法兔抗人VEGF多克隆抗体、鼠抗人CD105单克隆抗体、鼠抗人D2-40单克隆抗体、PV9000二步法免疫检测试剂盒等均购自北京中杉金桥生物技术有限公司。所取标本常规处理、石蜡切片，常规HE染色。免疫组化采用高压修复法，余均按说明书操作。

1.3结果判定以磷酸盐缓冲液(PBS)液代替一抗作为阴性对照，以已知结直肠癌阳性切片作为阳性对照。由两名病理学医师在显微镜下进行双盲阅片。

1.3.1VEGF的结果判定参照Jawhari等〔3〕的方法。400倍视野下随机选取的5个不相重叠区域进行观察，根据显色程度与显色数量分别计分。显色程度：不显色0分；浅黄色1分；黄色2分，棕黄色3分。显色数量：(X=阳性细胞数)X<6%，0分；6%≤X<25%，1分；25%≤X<50%，2分；50%≤X<75%，3分；75%≤X，4分。取5个视野两数值相乘的平均值，即为该切片计分。计分≤4，为阴性；4<计分，为阳性。

1.3.2CD105与D2-40的结果判定参照Weidner等〔4〕报道的方法，100倍镜下选取管腔密度最高处，作为主要观察区；400倍镜下，于主要观察区内随机选取5个视野计数(染成棕褐色的单个内皮细胞、内皮细胞簇或直径<8个红细胞大小的管腔给予计数)，取平均值。

1.4统计学方法采用SPSS13.0统计软件行χ2检验及秩和检验。各指标的相关性用Spearman相关分析法。

2结果

2.1VEGF的表达及其与临床病理因素间的关系VEGF在癌旁正常组织中为细胞质呈浅黄色的阳性表达，而在结直肠癌组织中它的表达往往增强，呈黄色或棕黄色。正常黏膜组VEGF仅有36.7%(11/30)的阳性表达，而在结直肠癌组阳性表达率为66.7%(66/99)，组间比较有明显差异(P<0.01)。VEGF阳性表达率与是否有淋巴结转移、性别呈正相关(P<0.01)。但与患者的年龄、结直肠癌的分化程度及发生部位无关(P>0.05)。见表1。

2.2CD105的表达及其与临床病理因素间的关系CD105在癌旁正常组织的血管内皮细胞中，表达较弱，MVD值较低(16.80)；而在结直肠癌组织中，CD105的表达增强，MVD值明显增高(79.61)，差异显著(P<0.01)。CD105标记的MVD值在有淋巴结转移组(54.67)显著高于无转移组(44.16，P<0.05)；在高中分化组(52.70)显著高于低分化组(36.00，P<0.05)。同时年龄≥60岁组MVD值(54.83)显著高于年龄<60岁组(42.88，P<0.05)，女性组(58.27)高于男性组(42.82，P<0.05)，但与癌的发生部位无相关性(P>0.05)。

表1　VEGF表达与结直肠癌患者临床病理因素的关系〔n(%)〕

与男性组比较：1)P<0.05；与有淋巴结转移组比较：2)P<0.01

2.3D2-40的表达及其与临床病理因素间的关系D2-40在癌旁正常组织的淋巴管内皮细胞中，为弱阳性表达，LVD值较低(42.22)；而在结直肠癌组织中，D2-40的表达增强，LVD值增高(71.90)，差异显著(P<0.01)。D2-40标记的LVD值在有淋巴结转移组(73.56)显著高于无淋巴结转移组(42.76，P<0.05)。但与患者的年龄、性别、癌的分化程度及发生部位等无明显相关性(P>0.05)。

2.4VEGF、CD105、D2-40表达的相关性VEGF蛋白与CD105蛋白的表达之间呈显著正相关(r=0.200，P=0.047)，CD105与D2-40的表达呈显著正相关(r=0.234，P=0.019)，VEGF与D2-40的表达之间无显著相关性(r=-0.078，P=0.442)。

3讨论

VEGF与CD105均可促进肿瘤新生血管的形成，在肿瘤的生长与血行转移中发挥重要作用；VEGF还可以促进肿瘤淋巴管的新生，在肿瘤的淋巴转移中发挥重要作用；CD105 也是新生肿瘤血管常用标记物，只表达于正在进行分裂增殖的新生血管内皮，标记效果强于CD34、CD31；D2-40能特异标记肿瘤淋巴管。本研究发现，VEGF、CD105、D2-40在癌旁正常组织中表达均较弱，而在癌中表达均增强；VEGF、CD105、D2-40在无淋巴结转移癌中的表达均较弱，在有淋巴结转移的癌中表达均增强。说明VEGF、CD105和D2-40在结直肠癌的生长与转移中发挥重要作用。

VEGF、CD105通过促进肿瘤血管的生成进而促进肿瘤的生长，同时促进肿瘤的血行转移。肿瘤需要大量的营养物质与氧气才能生长，它们主要由肿瘤新生血管提供。若无新生血管形成，当肿瘤直径>2~3 mm，肿瘤中心就会萎缩、坏死。而没有新生血管的形成，肿瘤也无法完成血行转移。VEGF是血管生成的关键调节因子；它通过与其受体结合，激发系列反应，促进血管内皮增殖，增加微血管通透性，降解细胞外基质，最后导致肿瘤新生血管的形成。CD105又称Endoglin，是转化生长因子β受体复合物的重要组成成分之一，它参与了肿瘤血管新生的重要信号的传递过程。CD105在多种恶性肿瘤均有表达，其表达强度与恶性程度或术后复发率正相关〔5，6〕。有研究发现，在结直肠腺瘤由轻度、重度不典型增生至腺癌发展的过程中，CD105标记的MVD值逐渐升高，表明CD105预测结直肠腺瘤癌变的有效指标，提示CD105有助于早期诊断疾病。CD105在多数肿瘤组织中表达明显增强，且与预后相关〔7，8〕。

肿瘤转移主要途径除血行转移外，还有淋巴转移；新生淋巴管的形成是淋巴转移的核心环节。VEGF与其受体结合后也能促进新生淋巴管的形成。D2-40能特异标记肿瘤淋巴管。D2-40抗体作为抗癌胚抗原M2A的IgG2a型鼠源性单克隆抗体，最初是从胎儿的睾丸和生殖细胞肿瘤中发现的。M2A表达于肿瘤新生淋巴管内皮细胞与幼稚毛细淋巴管内皮细胞，而不表达于血管内皮 。D2-40检测的特异性和敏感度均高于其他分子标记物〔9，10〕。现在认为，病灶中的LVD反映肿瘤淋巴管生成状态，与肿瘤的分期和淋巴结转移有关〔11〕。郝秀轻等〔12〕研究发现食管癌周边区淋巴管明显高于中心区和正常组织。

本研究发现，VEGF表达的阳性率及CD105标记的MVD值均与性别相关，未见文献报道。VEGF在男性表达的阳性率高于女性，男性CD105标记的MVD值明显低于女性，提示男女体内的某些差别(如雌激素水平)，可能是造成VEGF与CD105表达差异的原因。CD105标记的MVD值与患者年龄呈正相关，提示随着年龄增加维持肿瘤生长所需的血管数也在增加。

VEGF可以促进肿瘤血管与淋巴管的新生，肿瘤血管的新生可以促进肿瘤的生长和血行转移，淋巴管的新生可以促进肿瘤的淋巴转移〔13〕。肿瘤的分期越高，VEGF、CD105、D2-40的表达越强，可见VEGF、CD105、D2-40在肿瘤的发生、发展过程中发挥重要作用。

4参考文献

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12郝秀轻,王鸿雁,郭颖,等.淋巴管生成在食管鳞癌进展中的意义〔J〕.河北北方学院学报(医学版),2010;27(3):8-11.

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〔2014-09-17修回〕

(编辑安冉冉/曹梦园)

〔中图分类号〕R735

〔文献标识码〕A

〔文章编号〕1005-9202(2016)05-1116-03；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.05.043

基金项目：河北省高等学校科学技术研究重点项目(No.ZD20131004)

第一作者：张林西(1968-)，男，教授，博士，主要从事消化道肿瘤研究。