间充质干细胞对老年慢性粒细胞白血病患者免疫调节功能的影响

刘　珂　阮林海

(河南科技大学第一附属医院血液科，河南　洛阳　471003)



间充质干细胞对老年慢性粒细胞白血病患者免疫调节功能的影响

刘珂阮林海

(河南科技大学第一附属医院血液科，河南洛阳471003)

〔摘要〕目的分析老年慢性粒细胞白血病(CML)骨髓来源的间充质干细胞(MSC)的免疫调节功能。方法老年CML患者15例，同时选取正常人来源的MSC 12例，评估T细胞的免疫调节功能。结果两组细胞的形态与免疫表型差异不明显，相对正常人，CML骨髓来源的MSC对T细胞增殖有减轻抑制作用，而对抑制T细胞的凋亡具有促进作用。在正常对照的MSC与PHA 刺激的单核细胞比例为1∶3时，可抑制T细胞增殖5%以下，而当CML骨髓来源的MSC与PHA 刺激的单核细胞培养时，可抑制T细胞增殖比例为45%；CML骨髓来源的MSC与T细胞培养后发现凋亡率上升明显，CD25、CD44、CD29凋亡率各自达到(5.7±2.1)%，(52.3±7.4)%，(28.1±9.2)%，对比正常人来源的MSC与经PHA诱发的T细胞共同培养后发现CD25、CD44、CD29综合凋亡率为(2.4±0.6)%，(19.5±6.5)%，(16.4±0.73)%。结论老年CML患者进行移植时应选用正常人干细胞,有利于保护血液系统正常结构和功能。

〔关键词〕间充质干细胞；慢性粒细胞白血病；免疫调节

白血病是临床常见的恶性血液病，常造成患者贫血、全身感染导致死亡〔1〕。而其中以慢性粒细胞白血病(CML)最为严重，对体内造血系统及免疫系统损伤最明显。造血干细胞可产生一系列血液因子，而传统观点认为间充质干细胞仅能刺激红细胞和白细胞系的产生，从而忽略了细胞自身功能〔2〕。间充质干细胞的免疫调节功能不仅在血液系统发挥重要作用，同时其免疫调节作用也有利于疾病的治疗。这种免疫调节作用可损害正常T细胞的生理代谢及作用发挥，T细胞数量减少，最终组织的功能减退，出现一系列免疫系统疾病〔3,4〕。本文对比正常人与老年CML患者骨髓的MSC的免疫调节功能。

1资料与方法

1.1一般资料2011年3月至2013年10月我院老年CML患者，男9例，女6例；年龄61~77岁，平均(66.2±2.3)岁。患者之间的年龄、职业、病史、住院时间均无明显差异(P>0.05)。诊断均符合临床通用的CML诊断标准〔5〕，且经实验室检查确诊，排除易引起混淆的其他疾病如淋巴瘤、小细胞性贫血、脾功能亢进等。再随机选取正常人12例，其中男7例，女5例，年龄60~75岁，平均(64.8±2.7)岁。

1.2MSC培养在无菌环境中采集骨髓10~20 ml置于事先清洗的试管中，随后转移至放入细胞分离液及稀释剂的离心管内，比例控制在1∶2。混匀后置于匀速离心机中进行旋转，设定2 000 r/min的转速，时间为30 min〔6〕。随后在白膜层进行试管的吸取，最终得出单个细胞，选用细胞培养液洗涤后进行计数及分类处理，在培养皿中进行培养，加入牛肉膏蛋白胨培养基，生长过程中密切观察形态，定期清理培养中悬浮物及更换培养液。最终待细胞融合后收集干细胞，进行低温贮存。

1.3免疫荧光法进行细胞免疫表型的测定收集完成的MSC进行分离后，充分洗涤以保证成分的唯一性，采用流式细胞仪中免疫荧光法测定。其中细胞内抗原Flk-1需要破坏细胞膜，故取适量细胞加入10%甲醛水溶液5℃下进行处理，最后使用Flk-1单克隆抗体进行检测；而其他细胞因子包括CD29、CD34、CD44、CD45、CD105、HLA-DR等，仅需分离纯化后加入相应单克隆抗体进行逐一检测〔7〕。最终将细胞贮存于低温环境中。

1.4MSC对T细胞增殖的影响对于正常人及MSC患者的外周血进行培养，采用离心法进行单个细胞的分离，放入牛肉膏蛋白胨培养基培养5 h后获取上层细胞，放入含RPMI1640培养基的中性细胞孔，每组培养3孔以保证准确性，保证在10%CO2且湿度适宜的环境下培养，3 d后进行观察。随后按照研究顺序分为4组实验：①空白对照组：仅加入T细胞而不加入细胞刺激因子；②反应对照组：加入T细胞后，同时加入刺激因子；③正常组：加入正常人MSC，保证MSC与T细胞比例在1∶10；④CML组：加入CML患者的MSC。培养完毕后加入35×103的3H-Tdr(来源于北京市放射与核医学研究所)进行计数，取各孔之间的平均数作为最终结果〔8〕。

1.5混合淋巴细胞反应刺激性T细胞与T细胞进行诱发性混合淋巴反应时，可分为4组进行研究：①空白对照组：反应过程中不加入刺激性T细胞而仅加入T细胞；②反应对照组：反应中加入T细胞，同时加入刺激性T细胞作为激发因子；③正常组：在T细胞及刺激性T细胞的基础上额外加入正常人的MSC，其中MSC与T细胞的比例维持在1∶10以起到最佳反应效果；④CML组：在T细胞及刺激性T细胞的基础上额外加入CML患者的MSC，其中MSC与T细胞的比例依然为1∶10。检测方法相同，观察反应结果〔9〕。

1.6MSC对T细胞周期的影响正常MSC与T细胞保持1∶10的比例时抑制作用最明显，故研究中始终维持此比例。采用加入3T3细胞组进行对比，各组均加入刺激因子，在牛肉膏蛋白胨培养基培养5 d后采集反应细胞，采用无水酒精浸泡1 h以进行细胞固定，随后选用磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗，染色后选用细胞仪进行细胞周期分析，运用冷冻法保证细胞周期计数的准确性。细胞周期定义为从一次分裂结束后到下一次分裂结束为止，注意区分细胞分裂的间期与分裂期，计数应准确。若同一细胞存在不同结果时，以合理范围内细胞周期相对较长者为最终结果。

1.7MSC对T细胞活化的影响按照前述的细胞培养方法进行细胞培养，分离出单个核的细胞，加入细胞刺激因子进行独立培养，其后分别混合正常人和CML、MSC进行共同培养，维持1∶10的研究比例，T细胞活性指标选用细胞仪监测所得的细胞因子表达指标，且不同细胞因子进行不同时间的观察。24 h内进行CD28的观测，48 h进行CD45的观测，最终7 d后进行CD72的表达测定，从多细胞因子的共同效应反映活化情况。

1.8MSC对T细胞凋亡的影响凋亡的检测采取Amanex计数法，在200 ml细胞悬液中均匀加入细胞并进行凋亡细胞的计数。选用前述方法进行正常人和CML培养并进行单个核的分离，加入细胞刺激因子后进行单独培养与T细胞的混合培养，5 d后通过Amanex-V指标进行细胞凋亡的检测，具体步骤为：①使用配置好的PBS进行细胞冲洗，采用linger液进行细胞的固定悬浮，进行细胞浓度的调整，保持在2×106/ml；②选取200 μl细胞悬液进行培养，加入Amanex-V试剂，混匀进行反应；③固定1 h后进行细胞计数，以细胞数量下降40%为凋亡明显的标志，统计两组细胞的凋亡比例〔10〕。

1.9统计学方法采用SPSS18.0软件行t及χ2检验。

2结果

2.1正常人和CML骨髓来源的MSC形态及免疫表型对比在光镜下观察正常人和CML骨髓来源的MSC形态无明显差异，虽然分布略有不同，但均呈成纤维细胞样附着于管壁生长，细胞间生长排列整齐，不具有特异性差异。检验两种细胞的免疫表型，发现细胞因子指标中表现为强阳的包括Flk-1及黏附因子CD29、CD44、CD105和CD106，阴性包括CD34、CD45、HLA-DR。故正常人和CML来源的MSC在形态及免疫表型上的差异无统计学意义。

2.2正常人和CML骨髓来源的MSC对T细胞增殖作用比较正常对照的结果与既往类似，而患者的增殖抑制作用减弱，且根据有无刺激和刺激因子分为三组。在正常对照的MSC与PHA 刺激的单核细胞比例为1∶3时，可抑制T细胞增殖5%以下，而当CML骨髓来源的MSC与PHA 刺激的单核细胞培养时，可抑制T细胞增殖的比例为45%；而在比例提升至1∶10及1∶100时此现象更明显。在混合淋巴细胞反应中，结果与之类似。相对正常人，CML骨髓来源的MSC对T细胞增殖有减轻抑制作用，且MSC比例越大时这种减轻抑制作用越明显。见图1。

图1　正常人和CML骨髓来源的MSC对T细胞增殖作用

2.3正常人和CML骨髓来源的MSC对T细胞周期作用比较选用正常人MSC与T细胞共同培养，发现可抑制T细胞正常周期，而选用CML骨髓来源MSC发现这种抑制作用减弱，具体表现为T细胞在增殖周期中大多数倾向于停留于G0/G1期，而少数倾向于S期，而分裂间期的缩短即可导致T细胞周期缩短。发现CML来源患者中此种趋势不明显，具有减弱的作用。为保证结果的准确性选用3T3细胞进行对比研究，发现3T3细胞改变T细胞增殖周期的作用不明显。为保证结果准确性采用T3组、3T3+Ts组作为对照，重点关注MSC+Ts与CML MSC+Ts的结果推测T细胞周期改变并根据对照组排除无关因素。见图2。

图2　正常人和CML骨髓来源的MSC对T细胞周期作用

2.4正常人和CML骨髓来源的MSC对T细胞凋亡作用比较CML骨髓来源的MSC与T细胞培养后发现凋亡率上升明显，CD25、CD44、CD29凋亡率各自达到(5.7±2.1)%，(52.3±7.4)%，(28.1±9.2)%，对比正常人来源的MSC与经PHA诱发的T细胞共同培养后发现CD25、CD44、CD29综合凋亡率为(2.4±0.6)%，(19.5±6.5)%，(16.4±0.73)%(t值分别为5.55、8.51、4.66，均P<0.05)。PHA刺激3 d后，T细胞凋亡率为(23.37±2.71)%，和正常的MSC共培养时为(14.1±0.65)%，而和骨髓增生异常综合征患者来源的MSC共培养时为(8.36±1.31)%。CML来源的MSC可以加强干细胞抑制T细胞凋亡的作用。CML来源的MSC除抑制T细胞增殖和活化的能力减弱外，其抑制T细胞凋亡的能力亦增强。

3讨论

白血病是影响当代人群存活率的一种常见恶性病症，近年来发病率和死亡率日益增加，而近年来CML研究日益增多〔11〕。而以对抗贫血及诱发造血为目的的传统治疗效果并不明显，无法长久维持患者造血功能，且产生一系列免疫系统问题〔12〕。目前探究CML发病机制可发现，免疫系统损害及免疫功能异常为影响发病的主要因素，CML往往合并免疫系统疾病，因此近年来考虑从MSC入手进行治疗，维持体内免疫系统的稳定性〔13〕。体内正常存在的MSC比例较小，其免疫调节功能易被忽略，但在免疫疗法中，可以通过外界输入等方法增加体内免疫细胞中MSC的比例，进而发挥对体内免疫系统的调节作用，此方法适应证广泛，既往已在器官移植等免疫反应中进行应用〔14〕。当MSC与T细胞比例在1∶100以上时，可忽略此种免疫效应而加大MSC比例时，在激活造血系统进行血液成分的再生之外还可非特异性修复免疫系统，减少因突变、肿瘤等因素对于免疫功能的破坏。MSC这种免疫功能可在体内或体外进行，其分布部位反映微环境位点。而目前考虑可用MSC抑制T细胞增殖、周期，而增强T细胞凋亡的作用进行CML治疗〔15〕。尤其对于免疫系统功能低下、造血功能丧失的血液系统疾病具有更大优势。

正常人MSC对T细胞的增殖、细胞周期及凋亡有抑制作用，而CML、MSC对T细胞的影响发生了一定改变。虽然在形态和免疫表型上两种MSC差异不明显，但CML患者MSC对T细胞的增殖、细胞周期的抑制下降而对T细胞凋亡的抑制作用增强，故难以维持体内免疫环境的稳态，容易产生自身免疫病等不良后果，故不建议进行自体移植。研究结束后可进行安全性分析，发现两种细胞研究中均出现了一定的误差性研究结果。主要包括细胞形态不清、增殖异常、凋亡明显等。误差性结果相对轻微，且在两组细胞的研究中差异无统计学意义，对后续研究干扰较小。

综上，CML发病时免疫调节功能缺失，骨髓MSC移植可以改善骨髓微环境和调节体内异常的免疫状态，有利于维持血液系统正常结构和功能，减少合并不良反应的发生〔16〕。

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〔2014-12-03修回〕

(编辑苑云杰)

〔中图分类号〕R394.2

〔文献标识码〕A

〔文章编号〕1005-9202(2016)05-1063-03；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.05.018

第一作者：刘珂(1976-)，女，主治医师，主要从事血液学研究。