高糖因素在人肾小球内皮细胞补体凝集素途径激活机制的作用

樊文星　肖　桦　杨秋萍　黄　洁　黄颂敏

(昆明医科大学第一附属医院肾脏内科，云南　昆明　650032)



高糖因素在人肾小球内皮细胞补体凝集素途径激活机制的作用

樊文星肖桦杨秋萍1黄洁黄颂敏2

(昆明医科大学第一附属医院肾脏内科，云南昆明650032)

〔摘要〕目的观察高浓度葡萄糖对人肾小球内皮细胞(HRGEC)表面补体凝集素途径(LCP)相关信号通路蛋白表达的影响。方法将HRGEC分3组：高糖组、正常糖组和甘露醇组，分析HRGEC细胞表面甘露聚糖结合凝集素(MBL)、C3及C5b-9沉积的变化。结果HRGEC表面MBL和C3沉积随糖作用时间的延长而增加，72 h达峰值(P<0.05)，随糖浓度的升高而增加，60 mmol/L达峰值(P<0.05)；高糖组HRGEC表面MBL、C3及C5b-9沉积均明显高于正常糖组和甘露醇组(P<0.05)。结论葡萄糖可随时间及浓度依赖性促进HRGEC表面MBL和C3沉积；高浓度葡萄糖刺激可能氧化应激诱导HRGEC表面糖基化发生改变，激活LCP途径，引发HRGEC表面C5b-9沉积的增加。

〔关键词〕高糖；人肾小球内皮细胞；补体凝集素途径；激活

糖尿病肾病(DN)是糖尿病(DM)的重要微血管并发症之一，也是慢性肾衰竭的主要原因。高血糖是DN发病的主要环境因素，高血糖可引起多元醇代谢通路激活、蛋白质非酶糖基化、蛋白激酶C过度活化，促进DN发生发展。DN发病过程中，肾小球内皮细胞位于血液与组织接触处，最先接触血液中的各种致病因子，为各种病理生理因素作用的自然靶细胞。当DM血糖异常持续升高而引发细胞功能紊乱时，内皮细胞便成为首当其冲的受害者〔1，2〕。本文拟采用人肾小球内皮细胞(HRGEC)，体外模拟高糖状态下补体凝集素途径(LCP)激活，设置不同的糖浓度和作用时间，观察HRGEC表面甘露聚糖结合凝集素(MBL)、C3及补体攻膜复合体(MAC)沉积的变化，探讨高糖因素在HRGEC的LCP激活机制中的作用。

1材料与方法

1.1试剂及仪器HRGECs、内皮细胞培养基(ECM)、胎牛血清(FBS)和内皮细胞生长因子(ECGF)购自ScienCell公司；甘露聚糖、Sepharose 4B、胰蛋白酶和抗人vWF抗体购自Sigma公司；小鼠抗人MBL单克隆抗体购自Hycult Biotechnology公司；异硫氰酸荧光素(FITC)标记小鼠抗人C3单克隆抗体购自LifeSpan公司；链霉亲和素-PE/Cy5购自Biolegend公司；小鼠抗人C5b-9单克隆抗体购自Santa Cruz公司；重组人MBL购自R&D公司。EPICS-XL型流式细胞仪：Beckman-Coulter公司；倒置显微镜：Olympus CK40；正置荧光显微镜：Olympus BX51；水平电泳仪：BIO-RAD公司；Gel Doc 1000凝胶成像系统：BIO-RAD公司。

1.2细胞培养将HRGEC加入ECM培养基培养，待细胞达80%融合，用0.25%胰蛋白酶/0.02%乙二胺四乙酸(EDTA)消化细胞5 min，加含5%胎牛血清的ECM培养基4 ml终止消化，收集细胞悬液，离心，接种于已装有ECM培养基的培养瓶，接种密度5×104个/ml，放入培养箱中继续培养，取第6代HRGEC。

1.3高浓度葡萄糖作用时间对细胞LCP通路激活的影响HRGEC予以30 mmol/L葡萄糖ECM培养基，分别作用0、12、24、48和72 h，更换培养液，加入30%MBL-Def HS+外源性MBL 1 μg/ml，作用4 h。

1.4不同葡萄糖浓度对细胞LCP通路激活的影响HRGEC分别给予0、15、30和60 mmol/L的葡萄糖ECM培养基刺激72 h，更换培养液，其余操作同1.3。

1.5不同干预条件对细胞LCP通路激活的影响高糖组：葡萄糖30 mmol/L的ECM培养基刺激72 h，更换培养液，其余操作同1.3；正常糖组：葡萄糖5 mmol/L+甘露醇25 mmol/L ECM培养基刺激72 h，其余操作同高糖组；甘露醇组：甘露醇30 mmol/L ECM培养基刺激72 h，其余干预条件同于高糖组。

1.6指标检测采用流式细胞术和免疫荧光检测HRGEC细胞表面MBL、C3及C5b-9沉积的变化。

1.7统计学方法采用SPSS17.0统计软件进行t检验。

2结果

2.1高浓度葡萄糖作用时间对HRGEC表面MBL和C3沉积的影响HRGEC表面MBL和C3沉积随30 mmol/L葡萄糖的作用时间的延长而呈现递增趋势(P<0.05)，72 h达高峰，见表1。

表1　高浓度葡萄糖作用时间对HRGEC表面MBL和

与0 h比较：1)P<0.05

2.2不同葡萄糖浓度对HRGEC表面MBL和C3沉积的影响HRGEC表面MBL和C3沉积随体外葡萄糖浓度升高而递增(P<0.05)，60 mmol/L达峰值，见表2。

2.3不同干预条件对HRGEC表面MBL和C3沉积的影响与正常糖及甘露醇组比，高糖组HRGEC表面MBL和C3沉积明显增高(P<0.05)，见表3。

表2　不同葡萄糖浓度对HRGEC表面MBL和

与0 mmol/L组比较：1)P<0.05

表3　不同体外干预条件对HRGEC表面MBL和

与正常糖组比较：1)P<0.05；与甘露醇组比较：2)P<0.05

2.4不同干预条件对HRGEC表面C5b-9沉积荧光强度的影响高糖组C5b-9(20.93±1.25),与正常糖组(0.93±0.15)及甘露醇组(0.87±0.15)比，沉积荧光强度明显增高，见图1。

图1　不同干预条件对HRGEC表面C5b-9沉积荧光强度的影响(×400)

3讨论

MBL是肝细胞分泌的血清糖蛋白，属于C型凝集素超家族中胶凝素家族成员，是天然免疫系统的模式识别分子。成熟MBL肽链自N端至C端依次分为：富含Cys的N端区、胶原样区(CLR)、颈区和C端糖识别区(CRD)。CRD是MBL分子识别功能区，可选择性识别多种病原体表面的糖结构；CLR是MBL分子效应功能区，MBL可通过此区与MBL相关丝氨酸蛋白酶(MASPs)结合形成复合物，该复合物可激活MASPs酶原，活化的MASPs酶原可激活与CLR相结合的MASPs(如MASP-2和MASP-1)，活化的MASP-2和MASP-1可间接或直接裂解C3，形成C5转化酶，激活LCP，形成末端效应产物C5b-9沉积于细胞表面。因此通过考察MBL(启动因子)、C3(中心环节)和C5b-9(末端效应产物)表达可以验证LCP激活过程〔3~6〕。

本文结果提示葡萄糖刺激时间和刺激浓度均可显著影响细胞表面LCP激活。HRGEC表面“MBL+C3共表达”及C5b-9沉积可代表着整个LCP激活的过程，本文结果表明高浓度的葡萄糖可促进人肾小球内皮细胞整个LCP激活过程，这种促进作用可能与渗透压无关。

高血糖引发的过氧化产物对血管内皮细胞损伤是DM慢性并发症机制中关键性的第一步。体内外研究均发现：高血糖能够直接引发DM患者和正常受试者的血管内皮损伤及内皮依赖性舒张反应减弱〔7，8〕，此效应是由自由基介导的，能够被抗氧化剂所逆转〔9，10〕。细胞缺氧和氧自由基的形成可能使细胞表面某些基团发生糖基化改变，导致细胞表面MBL沉积增加和LCP激活〔11~13〕。内皮细胞位于血液与组织接触处，这使它成为自身内皮细胞或者炎症反应中的粒细胞产生的氧化剂的一种潜在靶目标〔13〕。Collard等〔11〕研究发现内皮氧化应激可能通过改变细胞膜表面的糖基化作用而引起LCP激活，导致内皮细胞表面MBL和C3沉积均明显增加。根据上述结果，推测高糖导致的氧化应激可能诱导HRGEC表面某些基团发生糖基化改变，发生糖基化改变的基团被MBL分子的CRD选择性识别和结合，从而激活MASPs酶原，使通过CLR与MBL分子相结合的MASPs活化，进而导致整个LCP途径激活。

综上，葡萄糖可时间及浓度依赖性促进HRGEC表面MBL和C3沉积；高浓度葡萄糖刺激可能氧化应激诱导HRGEC表面糖基化发生改变，激活LCP途径，引发HRGEC表面C5b-9沉积的增加。

4参考文献

1Khan Mohammed A，Medarametla C，Rabbani MM，etal.Role of a clinical pharmacist in managing diabetic nephropathy：an approach of pharmaceutical care plan〔J〕.J Diabet Metab Disord，2015；4(10)：82-6.

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3Jenny L，Ajjan R，King R，etal.Plasma levels of mannan-binding lectin-associated serine proteases MASP-1 and MASP-2 are elevated in type 1 diabetes and correlate with glycaemic control〔J〕.Clin Exp Immunol，2015；180(2)：227-32.

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6Keizer MP，Pouw RB，Kamp AM，etal.TFPI inhibits lectin pathway of complement activation by direct interaction with MASP-2〔J〕.Eur J Immunol，2015；45(2)：544-50.

7Perez Gutierrez RM，de Jesus Martinez Ortiz M.Beneficial effect of Azadirachta indica on advanced glycation end-product in streptozotocin-diabetic rat〔J〕.Pharm Biol，2014；52(11)：1435-44.

8Lankin V，Konovalova G，Tikhaze A，etal.The initiation of free radical peroxidation of low-density lipoproteins by glucose and its metabolite methylglyoxal：a common molecular mechanism of vascular wall injure in atherosclerosis and diabetes〔J〕.Mol Cell Biochem，2014；395(1-2)：241-52.

9Babizhayev MA.Patenting strategies，the authentication US fiscal methodology，discovery and development of imidazole-containing peptide compounds with free-radical scavenging and transglycating properties acting as targeted drug regulators and homeostatic agents with diverse therapeutic activities for pharmacy of diabetes and metabolic diseases〔J〕.Expert Opin Ther Pat，2015；25(11)：1-21.

10Moinuddin Ansari NA，Shahab U，Habeeb S,etal.Immuno-chemistry of hydroxyl radical modified GAD-65：a possible role in experimental and human diabetes mellitus〔J〕.IUBMB Life，2015；67(10)：746-56.

11Collard CD，Lekowski R，Jordan JE，etal.Complement activation following oxidative stress〔J〕.Mol Immunol，1999；36(13-14)：941-8.

12Rosbjerg A，Munthe-Fog L，Garred P，etal.Heterocomplex formation between MBL/ficolin/CL-11-associated serine protease-1 and-3 and MBL/ficolin/CL-11-associated protein-1〔J〕.J Immunol，2014；192(9)：4352-60.

13Skjoedt MO，Hummelshoj T，Palarasah Y，etal.Serum concentration and interaction properties of MBL/ficolin associated protein-1〔J〕.Immunobiology，2011；216(5)：625-32.

〔2014-12-17修回〕

(编辑苑云杰)

《中国老年学杂志》被国际数家数据库、检索性期刊检索机构收录情况

根据国际检索机构给中国科学技术期刊编辑学会国际交流工作委员会、中国高等学校自然科学学报研究会对外联络委员会发来的电子邮件及其附件统计整理, 《中国老年学杂志》2009年又被4种国际重要检索系统列为来源期刊:

1)美国化学文摘(CA)，CODEN ZLZHAO，http://www.lib.dlut.edu.cn/layersec.asp；

2)波兰《哥白尼索引》(IC, Index of Copernicus), http://journals.indexcopernicus. com/karta. Php;

3)日本《科学技术社(中国文献数据库)》(JST, Japan Science & Technology Agency) (Chinese Bibliographic Database);

4)美国《乌利希期刊指南》(UPD,Ulrich′s Periodicals Directory), http://www. ulrichsweb. com/ ulrichsweb/；

5)美国《剑桥科学文摘：生物科学》(CSA：BS)。

〔中图分类号〕R692.6

〔文献标识码〕A

〔文章编号〕1005-9202(2016)05-1035-03；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.05.005

基金项目：2013年度云南省教育厅科学研究基金项目(No.2013Y289)

1昆明医科大学第一附属医院干疗科2四川大学华西医院肾脏内科

第一作者：樊文星(1981-)，男，医学博士，讲师，主治医师，主要从事肾脏病研究。