安肠愈疡汤对溃疡性结肠炎大鼠结肠组织中TFF3、MUC2和TLR4基因表达的影响*



安肠愈疡汤对溃疡性结肠炎大鼠结肠组织中TFF3、MUC2和TLR4基因表达的影响*

迟莉丽1#袁浩1宋钦兰1程艳1孙大娟1闫华1王帅1梁峻尉1张晶晶2

山东中医药大学附属医院脾胃病科1(250011)山东中医药大学中西医结合专业2

背景：TLR4可介导免疫和炎症反应，TFF3、MUC2为肠黏膜保护因子，维持肠黏膜屏障功能。目的：观察安肠愈疡汤对溃疡性结肠炎大鼠结肠组织中TFF3、MUC2和TLR4基因表达的影响。方法：应用TNBS制备溃疡性结肠炎大鼠模型。将90只Wistar大鼠随机分为空白对照组、模型组、安肠愈疡汤低、中、高剂量组和美沙拉嗪组，分别给予蒸馏水、不同剂量安肠愈疡汤和美沙拉嗪。21 d后处死大鼠，行结肠黏膜组织病理学评分，采用RT-PCR法检测结肠组织中TFF3、MUC2和TLR4基因表达。结果：与模型组相比，安肠愈疡汤中、高剂量组和美沙拉嗪组组织病理学评分、TLR4表达均显著降低(P<0.05)，TFF3、MUC2表达均显著升高(P<0.05)。与安肠愈疡汤中剂量组相比，安肠愈疡汤高剂量组和美沙拉嗪组组织病理学评分显著降低(P<0.05)，TFF3表达显著升高(P<0.01)。与安肠愈疡汤中剂量组和美沙拉嗪组相比，安肠愈疡汤高剂量组MUC2表达显著升高(P<0.01)，TLR4表达显著降低(P<0.01)。结论：安肠愈疡汤可明显促进溃疡性结肠炎大鼠结肠黏膜修复，其作用机制可能与上调TFF3和MUC2基因表达以及下调TLR4基因表达有关。

关键词结肠炎，溃疡性；安肠愈疡汤；三叶因子3；黏蛋白2；Toll样受体4；治疗

Effect of Anchang Yuyang Decoction on Colon Tissue TFF3, MUC2 and TLR4 Gene Expressions in Rats with Ulcerative Colitis

CHILili1,YUANHao1,SONGQinlan1,CHENGYan1,SUNDajuan1,YANHua1,WANGShuai1,LIANGJunwei1,ZHANGJingjing2.1DepartmentofGastroenterology,AffiliatedHospitalofShandongUniversityofTraditionalChineseMedicine,Jinan(250011);2IntegratedTraditionalandWesternMedicine,ShandongUniversityofTraditionalChineseMedicine,Jinan

Background: TLR4 can mediate immune and inflammatory responses, TFF3, MUC2 are the intestinal mucosa protection factor and can maintain the intestinal barrier function. Aims: To investigate the effect of Anchang Yuyang decoction on colon tissue TFF3, MUC2 and TLR4 gene expressions in rats with ulcerative colitis. Methods: TNBS was used to establish ulcerative colitis model in rats. Ninety Wistar rats were randomly divided into normal control group, model group, low, moderate and high dose Anchang Yuyang decoction groups and mesalazine group, and distilled water, different concentrations of Anchang Yuyang decoction and mesalazine were given respectively. All the rats were sacrificed after 21 days. Colonic histopathological score was assessed, and RT-PCR was used to detect gene expressions of colon tissue TFF3, MUC2 and TLR4. Results: Compared with model group, histopathological score and TLR4 expression were significantly decreased in moderate, high dose Anchang Yuyang decoction groups and mesalazine group (P<0.05), expressions of TFF3 and MUC2 were significantly increased (P<0.05). Compared with moderate dose Anchang Yuyang decoction group, histopathological score in high dose Anchang Yuyang decoction group and mesalazine group was significantly decreased (P<0.05), and TFF3 expression was significantly increased (P<0.01). Compared with moderate dose Anchang Yuyang decoction group and mesalazine group, MUC2 expression in high dose Anchang Yuyang decoction group was significantly increased (P<0.01), and TLR4 expression was significantly decreased (P<0.01). Conclusions: Anchang Yuyang decoction can promote the repair of colonic mucosa in rats with ulcerative colitis, and its mechanism may be related to the increase of TFF3 and MUC2 gene expressions and down regulation of TLR4 gene expression.

Key wordsColitis, Ulcerative;Anchang Yuyang Decoction;Trefoil Factor 3;Mucin-2;

Toll-Like Receptor 4;Therapy

溃疡性结肠炎(UC)是一种主要累及直肠、结肠黏膜和黏膜下层的慢性非特异性炎症，其病因和发病机制目前尚未完全阐明。西医治疗UC以氨基水杨酸类、激素等药物为主，存在不良反应多、费用昂贵、易复发等缺点，中医药治疗UC已成为研究热点。本研究的前期研究[1-3]发现，中药安肠愈疡汤可通过下调促炎因子白细胞介素(IL)-1、IL-8、肿瘤坏死因子(TNF)-α水平以及上调抗炎因子IL-10、IL-13水平，从而起治疗UC的作用。在此基础上，本研究通过评估安肠愈疡汤对UC大鼠结肠组织中肠三叶因子(TFF3)、黏蛋白2(MUC2)和Toll样受体4(TLR4)基因表达的影响，旨在从基因水平上探讨安肠愈疡汤治疗UC的机制。

材料与方法

一、实验动物、药物、主要试剂和仪器

SPF级Wistar大鼠90只，鼠龄10~11周，雌雄各半，体质量(200±10) g，由鲁抗医药股份有限公司提供，动物合格证号：SCXK(鲁)2013 0001。

2, 4, 6-三硝基苯磺酸(TNBS)溶液(上海源叶生物科技有限公司)；安肠愈疡汤(含生黄芪、薏苡仁、炒白术、黄连、黄芩、败酱草、白及、地榆炭、木香、槟榔、当归、白芍、防风、生甘草)由山东中医药大学附属医院中药制剂室提供，含生药量为3.00 g/mL；美沙拉嗪缓释颗粒[Ethypharm(法国)]；Trizol Reagent、2×Taq MasterMix(北京康为世纪生物科技有限公司)；dNTP、RNA酶抑制剂[生工生物工程(上海)股份有限公司]，M-MLV逆转录酶(北京Promega公司)。

凝胶成像分析系统型号GL2200(美国Alpha)，EC250-90电泳仪(德国Biometro)，PCR仪(英国Thermo Hybaid)。

二、研究方法

1. 模型制备和实验分组：大鼠适应性饲养1周后，随机分为6组：空白对照组、模型组、安肠愈疡汤低、中、高剂量组、美沙拉嗪组，每组15只，各组大鼠体质量无明显差异(P>0.05)。参照王皓等[4]的研究，采用TNBS灌肠法制备UC大鼠模型：大鼠禁食、不禁水24 h，腹腔注射10%水合氯醛进行麻醉。将直径2.0 mm、长12 cm的硅胶管插入结肠距肛门约8 cm处，以100 mg/kg TNBS加50%乙醇0.25 mL的混合试剂快速注入肛门，提尾倒立1 min，待大鼠自然苏醒后常规饲养。

制备UC大鼠模型的第3 d，安肠愈疡汤低、中、高剂量组分别给予含生药为0.75 g/mL、1.5 g/mL、3 g/mL的药物灌胃，美沙拉嗪组给予0.035 g/mL美沙拉嗪混悬液灌胃，空白对照组、模型组以蒸馏水灌胃。各组灌胃溶液体积均为2 mL，每天2次，连续21 d。

实验过程中，模型组、安肠愈疡汤低剂量组、美沙拉嗪组各死亡1只大鼠。另因客观条件限制，每组各选取6只大鼠用于后续实验研究。

2. 观察结肠病理改变情况：灌胃21 d后，处死大鼠，取距肛门8 cm以上的结肠组织，沿肠系膜纵轴剪开，0.9% NaCl溶液冲洗。取病变最明显的组织0.5 cm左右，以4.0%多聚甲醛溶液固定，石蜡包埋，4 μm 连续切片，行HE染色。光镜下观察结肠黏膜炎症浸润情况，并采用Dieleman等[5]的标准行组织病理学评分。

3. RT-PCR法检测结肠组织TFF3、MUC2、TLR4基因表达：采用Trizol一步法提取组织总RNA，紫外分光光度仪验证RNA纯度和浓度。采用oligo dT为RT反应引物，总反应体系为60 μL，含4 μg总RNA、5×RT缓冲液12 μL、RNA酶抑制剂120 U、10 mmol/L dNTP 6 μL，M-MLV 600 U，DEPC水补足至60 μL。反应条件：70 ℃ 5 min，37 ℃ 5 min，42 ℃ 1 h，70 ℃ 10 min，逆转录成cDNA。各基因PCR引物(表1)由上海博尚生物技术有限公司合成，总反应体积25 μL，包括2× Taq MasterMix 12.5 μL，cDNA 4 μL，上、下游目的基因引物 10 μmol/L 2 μL，DEPC水补足至25 μL。反应条件：94 ℃预变性 5 min；94 ℃变性1 min，58~60 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，共26个循环；70 ℃终延伸10 min。PCR产物行1.5%琼脂糖凝胶电泳，应用凝胶成像分析系统进行分析，以β-actin为内参照，以各基因与β-actin灰度值的比值作为各基因相对表达量。

三、统计学分析

结果

一、结肠组织病理学变化

空白对照组大鼠结肠黏膜组织结构完整，未见黏膜糜烂溃疡形成，间质偶见散在少量炎性细胞浸润。模型组大鼠可见较大面积的溃疡，部分深达肌层；腺体破坏，结构不完整，杯状细胞减少，炎性细胞大量浸润，以中性粒细胞为主。安肠愈疡汤不同剂量组和美沙拉嗪组结肠组织表现为轻、中度慢性炎症，黏膜和黏膜下层仍有中等量炎性细胞浸润，局部黏膜可见糜烂、溃疡愈合，但较模型组明显好转(图1)。

二、结肠黏膜组织病理学评分

模型组结肠组织病理学评分较空白对照组显著升高(P<0.01)，说明UC大鼠造模成功。与模型组相比，安肠愈疡汤中、高剂量组和美沙拉嗪组评分均不同程度降低(P<0.05或P<0.01)，安肠愈疡汤高剂量组和美沙拉嗪组评分又显著低于安肠愈疡汤中剂量组(P<0.05)，但安肠愈疡汤高剂量组与美沙拉嗪组相比差异无统计学意义(P>0.05)(表2)。

三、结肠组织TFF3、MUC2、TLR4基因表达

与空白对照组相比，模型组TFF3、MUC2表达显著降低(P<0.05)，TLR4表达显著升高(P<0.05)。与模型组相比，安肠愈疡汤低、中、高剂量组和美沙拉嗪组TFF3表达均显著升高(P<0.05或P<0.01)，安肠愈疡汤高剂量组和美沙拉嗪组又显著高于安肠愈疡汤中剂量组(P<0.01)，但安肠愈疡汤高剂量组与美沙拉嗪组无明显差异(P>0.05)； 安肠愈疡汤低、中、高剂量组和美沙拉嗪组MUC2表达均显著升高(P<0.05或P<0.01)，安肠愈疡汤高剂量组又显著高于安肠愈疡汤中剂量组和美沙拉嗪组(P<0.01)；安肠愈疡汤中、高剂量组和美沙拉嗪组TLR4表达显著降低(P<0.01)，安肠愈疡汤高剂量组又显著低于安肠愈疡汤中剂量组和美沙拉嗪组(P<0.01)(表2、图2)。

表1　PCR引物和产物长度

A：空白对照组；B：模型组；C：安肠愈疡汤低剂量组；D：安肠愈疡汤中剂量组；E：安肠愈疡汤高剂量组；F：美沙拉嗪组

组 别例数组织病理学评分TFF3MUC2TLR4空白对照组60.500±0.577**0.502±0.137*0.174±0.009*0.649±0.184*模型组67.333±1.1540.440±0.4410.162±0.0090.805±0.094安肠愈疡汤组 低剂量65.800±1.6430.521±0.078*0.205±0.016*0.789±0.150 中剂量64.800±0.837*0.602±0.033**0.264±0.006**0.328±0.034** 高剂量63.200±0.837**▲0.758±0.013**▲▲0.350±0.023**##▲▲0.283±0.013**##▲▲美沙拉嗪组63.600±0.548*▲0.789±0.090**▲▲0.228±0.011**▲▲0.414±0.041**▲▲

与模型组比较，*P<0.05，**P<0.01；与安肠愈疡汤中剂量组比较，▲P<0.05，▲▲P<0.01；与美沙拉嗪组比较，#P<0.05，##P<0.01

泳道1：空白对照组；泳道2：模型组；泳道3：安肠愈疡汤低剂量组；泳道4：安肠愈疡汤中剂量组；泳道5：安肠愈疡汤高剂量组；泳道6：美沙拉嗪组

图2各组大鼠结肠组织TFF3、MUC2、TLR4基因表达(RT-PCR法)

讨论

虽然UC的病因和发病机制尚未完全阐明，但免疫反应异常被认为在其发病中扮演重要角色，其中细胞因子在UC发病中的作用已得到公认[1-3,6-8]。近年研究[9-13]显示TLRs/NF-κB通路对调控细胞因子的释放具有重要作用。TLR4蛋白主要表达于胃和结肠组织[14]，其作为一种模式识别受体，可对肠腔内病原模式识别分子(PAMPs)进行模式识别，经一系列信号转导分子最终促使核因子NF-κB的激活，促进多种细胞因子的释放，进而调节炎症递质水平。过量TLR4会导致NF-κB的过度激活，产生持续扩大的炎症反应，因此TLR4是介导免疫和炎症反应的主体。

TFF3是三叶因子家族成员之一，由杯状细胞分泌并特异性分布于肠黏膜表面，其既是肠道特异性黏膜修复因子，又是黏膜损伤的快速反应肽，具有保护和重建肠上皮、维持肠上皮细胞屏障功能的作用[15-16]，同时还可明显抑制炎症介质[17]。MUC2基因是一种黏蛋白核心肽基因，广泛表达于肠黏膜，研究[18-21]表明MUC2对肠黏膜有直接的保护作用，一旦表达下降，肠道屏障功能受损，通透性增高，肠腔内的抗原、内毒素等促炎物质诱发免疫反应，从而促进UC的发生、发展。

中医虽然无UC之病名，但根据其临床表现归属 “休息痢”、“久痢”之范畴。本课题组通过复习文献并结合多年的临床经验，认为本病为本虚标实之证，脾气亏虚为发病之本，湿热邪毒为致病之标，湿热蕴肠，气滞络瘀为基本病机。湿热瘀毒病邪不能及时清除，糟粕之物从肠道入侵人体，以致疾病反复发作，缠绵难愈，毒邪留恋，正气愈虚，毒邪弥漫，侵及他脏，使疾病沉重难愈。基于以上病机确立了健脾益气以固本，清热化湿以治标，同时注重调气行血的治疗大法。中药复方安肠愈疡汤补中有泻，寓泻于补，相反相成，集健脾益气、清热化湿、调气活血、凉血止血于一炉，标本兼治，切合病机。

本研究发现，高剂量安肠愈疡汤具有明确治疗UC的作用，不仅可明显改善和修复UC大鼠的结肠组织黏膜，还可上调结肠组织中TFF3、MUC2表达，下调TLR4表达。由此推测，安肠愈疡汤可能是通过抑制TLRs识别受体的表达，抑制了其作为启动蛋白的炎症反应链的扩大，减少炎症介质的释放，发挥抗炎作用。另一方面，安肠愈疡汤还通过上调肠黏膜保护因子的表达，从而达到防治UC的作用。但本研究未从蛋白水平进行分析，后续将进一步从蛋白水平研究安肠愈疡汤治疗UC的作用机制。此外，这些肠黏膜保护因子是直接作用于肠黏膜组织发挥修复作用还是通过抑制TLR4/NF-κB通路的信号转导和炎症反应而发挥增强黏膜修复的作用，其深层机制有待进一步研究。

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(2015-07-10收稿；2015-08-14修回)

*基金项目：山东省自然科学基金，编号：ZR2012HL11

DOI:10.3969/j.issn.1008-7125.2016.02.005

#Email: chililiyl@163.com