黄鳝性腺发育过程中Amh和SOX9基因的表达分析

吴昊伟，　王　倩，　荣　萍，　付春雪，　贾沛轩，　曲宪成

(上海海洋大学 水产与生命学院,上海　201306)



黄鳝性腺发育过程中Amh和SOX9基因的表达分析

吴昊伟，王倩，荣萍，付春雪，贾沛轩，曲宪成

(上海海洋大学 水产与生命学院,上海201306)

摘要:文章研究了黄鳝性腺发育过程中抗苗勒氏管激素(anti-Mullerian hormone,Amh)基因和Sry相关高泳动类非组蛋白基因9(Sry-related high mobility group-box gene 9,SOX9)2个基因的表达量变化及关系,进而推断其基因表达通路,为研究黄鳝性逆转过程中基因的调控理论奠定基础。文章提取黄鳝Ⅰ龄卵巢(Ⅱ期卵巢)、Ⅲ龄卵巢、Ⅱ龄间期性腺早期、Ⅱ龄间期性腺后期、Ⅲ龄精巢5个时期的性腺组织RNA并反转录成cDNA,通过半定量和荧光定量聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)对其表达量进行定量分析。结果表明,Amh和SOX9基因在黄鳝性腺发育过程中的表达没有特异性,随着卵巢的败育和精巢的发育,表达量明显升高。Amh基因在Ⅲ龄精巢表达有显著增高,SOX9基因的表达量高于Amh(Ⅲ龄精巢例外)。Amh和SOX9基因的表达呈现正相关,后期Amh基因的表达量显著升高可能是由于存在一个诱导SOX9基因表达的信号,两者在黄鳝性逆转过程及精巢的发育过程中存在一定的协同关系,可能存在Amh—SOX9基因信号通路。

关键词:黄鳝;半定量聚合酶链式反应;荧光定量聚合酶链式反应;表达分析

0引言

黄鳝(Monopterusalbus)按分类学隶属于合鳃目、合鳃科，是我国著名的淡水鱼之一,主要栖息于湖泊、河流等水体中,营底栖生活。因其肉味鲜美、营养价值高而深受广大消费者欢迎[1]。黄鳝生命周期中早期为雌性,卵巢退化后,精巢组织和卵巢同时存在于性腺中,随着性腺的发育,卵巢组织完全消失,最后进入雄性阶段,这是一种典型的性转变现象[2-3]。黄鳝的基因组只有600 Mbp,是脊椎动物中的原始物种,也是研究生物进化机制、比较基因组学和发育生物学很好的模式生物[4]。但目前由于我国黄鳝野生资源紧缺,过渡捕捞严重,水资源及苗种数量的限制，使黄鳝的人工养殖效率不高,无法满足市场的需求[5]。研究黄鳝性腺发育过程中性逆转的机制,能够人为控制黄鳝性逆转的发生,使黄鳝保持雌性状态,增加雌鳝亲本的数量及降低养殖成本,进而提高幼鳝苗种数量[3]。因此研究黄鳝性逆转有重要的经济意义，同时可以为理解脊椎动物的性别决定与分化机制、丰富鱼类性别决定的基因调控模式提供参考[6]。

抗苗勒氏管激素(anti-Mullerian hormone,Amh)基因在哺乳动物中发现,是由胚胎早期精巢的支持细胞产生的,并引起苗勒氏管的退化[7]。Sry相关高泳动类非组蛋白基因(Sry-related high mobility group-box gene 9，SOX9)是脊椎动物中雄性性别决定方面的关键基因。SOX9和Amh基因表达都与雄性性别决定和分化有关。文献[8]用包含人类Sry基因中保守区域的探针进行杂交,发现了在黄鳝基因组中Sry的同源基因。文献[9]在黄鳝中克隆得到了SOX9a1 和SOX9a转录产物,原位杂交结果显示,2种转录产物在卵巢、精巢和间期性腺中都有表达,主要是在性腺的生殖上皮细胞的外层中表达。文献[10]克隆了黄鳝AmhcDNA全长序列,在各期的性腺中利用原位杂交技术分析基因表达，发现其在性腺发育各期均有表达,在间期性腺中,Amh基因不仅在早期精巢的未分化的支持细胞中表达,同时在败育的卵母细胞颗粒中也有表达,这个特点与哺乳动物有所区别。

目前研究得出哺乳动物中是以Sry为主导的一个多基因参与协调表达的级联雄性调控通路[11],在哺乳动物中雄性发育通路是Sry—SOX9—Amh。但在后续研究发现，在鱼类等其他低等脊椎动物中,雄性性别分化通路与哺乳动物相比很保守,但又有所差别[12],体细胞基因SOX9参与了鱼类精巢的形成,Amh基因作为一个信号通路伴随着其他调控因子存在。有研究者认为，高等哺乳动物中雄性性别决定的基因表达通路是Sry—SOX9—Amh,而在鱼类等其他低等脊椎动物中雄性性别决定的基因表达通路是Amh—SOX9[13-14]。从以上研究可看出,雄性表达通路差异在于Amh和SOX9基因表达先后差异,有关黄鳝的研究中关于这2个基因通路的报道不多,所以研究该通路的差异性可以发现鱼类乃至低等脊椎动物雄性性别决定和分化哺乳类的差异。

本文从哺乳动物中研究的SOX9及Amh基因入手,在已知的青鳉鱼Amh—SOX9表达通路基础上,通过半定量聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)及荧光定量PCR定量分析探究黄鳝性腺发育中的Ⅰ龄卵巢(Ⅱ期卵巢) 、Ⅲ龄卵巢 、Ⅱ龄间期性腺早期、Ⅱ龄间期性腺后期、Ⅲ龄精巢(其中Ⅲ龄卵巢与Ⅲ龄精巢同时出现,可能是由于该黄鳝生长条件好生长快,而黄鳝性逆转需要较长时间,所以其仍然为雌性)5个时期的2个基因表达量高低,验证在黄鳝性逆转过程中Amh和SOX9 2个关键基因的表达通路,从而为明确黄鳝性逆转的机制提供参考,同时也为鱼类性别决定和分化的研究提供帮助。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1样本采集

本文试验样本购自上海市临港新芦苑农贸市场及安徽省农科院水产研究所。用颈椎切断法处死黄鳝,采集性腺(大约为100 ～150 mg),该试验获得5个时期性腺,分别为Ⅰ龄卵巢(Ⅱ期卵巢)、Ⅲ龄卵巢、Ⅱ龄间期性腺早期、Ⅱ龄间期性腺后期、Ⅲ龄精巢,之后放入液氮速冻,于-80 ℃保存备用。

1.1.2主要试剂

RNA抽提试剂Trizol Reagent购自invitrogen; Taq DNA聚合酶、dNTP Mix(10 mol/L)、DL 2000 DNA Marker、SYBR Premix Ex TaqTM、RT-PCR Kit、RNase inhibitor、Oligo(dT)18等购自Takara工程(上海皓嘉)有限公司;所用引物由本文设计后由上海生工生物工程有限公司合成。

1.1.3引物

半定量引物设计是根据美国国家生物技术信息中心(national center of biotechndogy information,NCBI)上已知的Amh、SOX9基因全长,于开放阅读框内设计1对PCR引物,以GeneBank中已发表的黄鳝 β-actin基因为内参基因,引物5′-3′序列如下:

Amh-F: CTGCTGAAGGCTTTGCAGAC;

Amh-R: AGCGGCATTCACACTCCTTTG;

SOX9-F: GAATCTCCTCGACCCTTAC；

SOX9-R:TCWGCTTCTTCCACAAACGG；

β-actin-F: ATCGCCGCACTCGTTGTTGAC；

β-actin-R: CCTGTTGGCTTTGGGGTTC。

荧光定量PCR引物同上。

1.2实验方法

1.2.15个时期组织总RNA的提取

分别从-80 ℃冰箱中取出5个时期性腺组织样本,取出100 mg置于冰上加入1 mL Trizol试剂,匀浆完全后利用氯仿进行抽提,异丙醇进行沉淀提取,最后用适量的0.1% DEPC-H2O溶解总RNA,并检测RNA的质量浓度。

1.2.2普通cDNA第1链的合成

分别以5个时期提取的总RNA为模板进行反转录合成普通cDNA第1链。具体操作过程如下:向0.2 mL的离心管加入2 μg总RNA,1 μL Oligo(dT)18 Primer和适量的0.1% DEPC-H2O,混匀并短暂离心；置于PCR仪中70 ℃哺育5 min,然后立即冰浴2 min;反应后加入4 μL 5×M-MLV Buffer、4 μL 10 mol/L dNTP Mix、0.5 μL RNase inhibitor、0.8 μL M-MLV 反转录酶,混匀并短暂离心,然后置于PCR仪中42 ℃反应1 h,70 ℃反应10 min,所得产物为cDNA第1链,-20 ℃保存备用。

1.2.3Amh和SOX9基因的半定量PCR分析

以β-actin为内参基因,以所合成的性腺5个时期的普通cDNA第1链为模板进行PCR扩增,初步检测基因在性腺中表达量变化及检测基因的表达是否具有组织特异性。

扩增体系为:10×PCR buffer 2.0 μL,dNTP 1.6 μL,PCR forward primer(10 μmol/L)1.0 μL,PCR reverse primer(10 μmol/L)1.0 μL,Template 1.0 μL,Taq DNA polymerase 0.1 μL,ddH2O 13.3 μL,总体积20.0 μL。

反应条件为: 94 ℃5 min;94 ℃30 s;Amh维持58.4 ℃、SOX9维持56.0 ℃、β-actin维持58.2 ℃;Tm 30 s,72 ℃45 s,共30个循环;72 ℃延伸3 min;4 ℃保存。结束后以1.2% 琼脂糖凝胶电泳检测结果。

1.2.42个基因的荧光定量PCR分析

利用SYBR Green I 荧光染料在 Applied Biosystems 7500 荧光定量 PCR 仪上精确检测Amh基因和SOX9基因在各期性腺之间表达量的关系。

荧光定量反应体系如下:SYBR Premix Ex Taq(Tli RNaseH Plus)(2×)10 μL,PCR forward primer(10 μmol/L)0.4 μL,PCR reverse primer(10 μmol/L)0.4 μL,Rox reference dyeⅡ(50×)0.4 μL,Template 2.0 μL,ddH2O 6.8 μL,总体积20.0 μL。

反应条件:95 ℃,30 s;95 ℃,5 s;60 ℃,34 s;40个循环。熔解曲线程序:95 ℃,1 min;60 ℃,1 min,从60 ℃开始至 95 ℃分析熔解曲线,每个循环升温 0.5 ℃。

反应结束后,收集实验数据,记录软件给出的荧光定量强度增加到阈值时的扩增循环数(Ct 值)。反应结束后收集数据,数据结果以 2-ΔΔCt的平均值±标准差表示。显著性检验采用 DunnettT3 软件,P<0.05 时为显著性差异,P<0.01 为极显著差异,数据利用 SPSS17.0 软件进行分析。

2结果与分析

2.12个基因的半定量PCR分析结果

Amh和SOX9基因的半定量分析结果如图1所示。由图1可以看出,Amh和SOX9基因在黄鳝性腺发育过程中没有特异性,在精巢、卵巢和间期性腺中都有表达,随着性腺发育电泳条带亮度呈现明显的上升趋势,说明两者表达量有着不同程度的增加,其中SOX9和Amh基因在早期卵巢中表达不明显,随着卵巢的败育和精巢的发育表达量明显升高。可以看出，这2个基因在早期卵巢与精巢中表达存在明显差异，亮度的变化趋势表明,Amh基因在精巢中的亮度要大于SOX9。本实验也证明了引物特异性良好,可以用作荧光定量实验。

1.Ⅰ龄卵巢(Ⅱ期卵巢)　2.Ⅲ龄卵巢　3.Ⅱ龄间期性腺早期

2.22个基因荧光定量PCR分析表达结果

运用SYBR Green I检测方法,以内参基因β-actin表达量为参照,验证2个基因随黄鳝性腺发育的表达情况,以5个性腺时期后一个时期对前一个时期的差异进行方差分析，结果见表1所列。

表1　各期性腺中Amh和SOX9基因相对表达量

注：“*”表示与前一组数据相比差异显著;“**”表示与前一组数据相比差异极显著；ΔΔCt表示(Ct目的基因-Ct内参基因)X期性腺-(Ct目的基因-Ct内参基因)Max

Amh基因和SOX9基因荧光定量结果表明,2个基因在各期性腺中均有表达,与半定量PCR结果相同,随着黄鳝性腺的发育,2个基因表达量逐渐增加。其中Amh基因在Ⅰ龄卵巢和Ⅲ龄卵巢,Ⅱ龄性腺间期早期和Ⅱ龄性腺间期后期的性腺发育过程中表达量变化大,呈现显著差异(P<0.05),在Ⅲ龄精巢中表达量变化很大,呈现极显著差异(P<0.01)；SOX9基因在Ⅰ龄卵巢和Ⅲ龄卵巢，Ⅲ龄卵巢和Ⅱ龄性腺间期早期的性腺发育过程中表达量变化大,呈现显著差异(P<0.05)，在Ⅱ龄性腺间期早期和Ⅱ龄性腺间期后期中表达量的变化很大，呈现极显著差异(P<0.01)。

3讨论

黄鳝的发育不同于其他硬骨鱼类,是一种雌雄同体并且雌性先熟的淡水鱼类,早期发育为雌性,后期则发育为雄性,中间经历一个雌雄间性的过程,该发育过程不可逆。黄鳝的所有个体决定性别的遗传因素是相同的,没有遗传上的雌雄之分,是一种发育上的而不是遗传上的雌雄异体[2]。关于黄鳝性逆转的机制一直是研究的热点,但有关其具体分子机制的研究并不多。为了研究这一原始物种的性别决定与分化机制,研究者做了大量的工作,对黄鳝性逆转研究已经明确了Vasa[15]、SOX9[8-9]、Dmrt1[16]、Amh[10]、P45011β[17]等基因的表达情况,但现阶段的研究均未取得突破性进展。

本文实验以黄鳝5个时期的性腺样本为材料,通过半定量PCR验证2个基因的表达是否具有明显的组织特异性。结果显示,Amh和SOX9基因在黄鳝精巢、卵巢和间期性腺中都有表达,两者表达量有着不同程度的增加,说明这2个基因在早期卵巢与精巢中表达存在明显差异。

荧光定量PCR结果与半定量PCR结果一致。Amh荧光定量结果显示,在Ⅰ龄卵巢表达量很低,这一时期是黄鳝卵巢发育时期,与其拮抗的Amh基因表达量很低;Ⅲ龄卵巢时期,Amh基因表达量达到了前者的2倍,有显著差异,该阶段已经到了卵巢发育中后期,在该阶段发育过程中卵巢发育的主要事件是卵母细胞卵黄颗粒的积累,该阶段卵巢发育迅速,活力较强,Amh基因表达量的显著变化与卵巢的快速发育存在一定的关系;在Ⅱ龄性腺间期早期及Ⅱ龄性腺间期后期,Amh基因表达量进一步升高,这一时期是黄鳝性逆转时期,伴随着卵巢组织的退化;在Ⅲ龄精巢中,Amh基因的表达量急剧增加,产生了极显著差异(P<0.01),这一时期是黄鳝精巢发育阶段,推测Amh基因作用逐步体现,使得卵巢结构完全退化,精巢结构全面产生,Amh基因高的表达量是一个基因表达信号使下游基因达到阈值,促进其表达。

SOX9基因荧光定量PCR结果与Amh基因类似,在Ⅱ龄性腺间期早期及后期中,SOX9基因表达量升高很快,这一时期SOX9基因会促进卵巢组织退化,精巢支持细胞产生。在Ⅲ龄精巢中,表达量与前一时期相比略有降低,认为应该属于实验误差,在Ⅲ龄精巢中表达量应该会高于间期。2个基因表达量变化较大阶段为黄鳝性腺由卵巢逐渐转化为精巢阶段,可以得出2个基因的表达式变化在黄鳝性逆转过程中起到一定作用。

黄鳝性逆转是一个复杂的过程,后续研究应该从以下几个方面进行:

(1) 进一步找寻上游基因的调控方式,研究在黄鳝的胚胎发育和仔鱼发育中一些关键基因的表达及定位。

(2) 进行基因敲除实验,进一步明确黄鳝体内在性逆转时期的基因表达通路。

(3) 研究关键基因的蛋白质产物,从蛋白质产物的生物学意义入手,突破单纯的克隆基因的局限。

(4) 研究已知基因相关的结构(如启动子),以利于更好地了解基因的表达和调控。

4结论

根据Amh和SOX9基因荧光定量PCR分析结果,可以得出两者的表达呈现正相关。在黄鳝性腺发育过程中,从早期性腺即有表达,Amh基因的表达量少量升高,SOX9基因表达显著升高。后期Amh基因的表达量显著升高可能是一个诱导SOX9基因表达的信号,两者在黄鳝性逆转过程及精巢的发育中存在一定的协同关系,可能是类似青鳉鱼的Amh—SOX9信号通路,该通路在黄鳝早期性腺发育及性逆转过程中会起到重要作用。本实验为黄鳝性逆转机制的研究和鱼类性别决定与分化提供了参考依据。

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(责任编辑闫杏丽)

Expression analysis ofAmhandSOX9 in gonads development during sex reversal in rice field eel

WU Hao-wei,WANG Qian，RONG Ping,FU Chun-xue,JIA Pei-xuan，QU Xian-cheng

(College of Fisheries and Life Science， Shanghai Ocean University， Shanghai 201306, China)

Abstract:The expression level and relationship between two genes i.e. anti-Mullerian hormone(Amh) and Sry-related high mobility group-box gene 9(SOX9) in gonads development during sex reversal in the rice field eel were investigated， and the gene expression pathway was concluded. The study laid foundation for the genes regulation theory during the sex reversal of the rice field eel. The cDNA of five gonadal samples including one-year-old ovary(ovary of stage Ⅱ), three-year-old ovary, two-year-old early ovotestis, two-year-old later ovotestis, and three-year-old testis were reversely transcribed from the extracted RNA. The expression of the two genes in each stage of the gonads was analyzed by using semi-quantitative polymerase chain reaction(PCR) and real-time fluorescence quantitative PCR. It was showed that the expression of Amh and SOX9 had no specificity during gonad development，with the ovary abortiveness and testis development，the transcription level significantly increased. The expression of Amh had a marked increase in three-year-old testis; the expression of SOX9 was higher than that of Amh except in three-year-old testis. It came to the conclusion that the expression of Amh and SOX9 may have positive correlation， the markedly increased expression of Amh in three-year-old testis may be a signaling pathway to induce the later expression of SOX9， which had a certain synergy relationship during the process of sex reversal and development of the testis in the rice field eel， which may be the gene chain like Amh-SOX9 in Oryzias latipes.

Key words:rice field eel; semi-quantitative polymerase chain reaction(PCR); fluorescence quantitative polymerase chain reaction(PCR); expression analysis

中图分类号:S917.4

文献标识码：A

文章编号：1003-5060(2016)02-0275-05

Doi:10.3969/j.issn.1003-5060.2016.02.025

作者简介：吴昊伟(1990-),男,安徽芜湖人,上海海洋大学硕士生;曲宪成(1965-),男,吉林榆树人,博士,上海海洋大学副教授,硕士生导师.

基金项目：农业部科技教育司资助项目(201003076)

收稿日期：2015-05-18；修回日期：2015-12-22