地衣芽孢杆菌降解茶皂素的研究

黄　浦，肖　瑜＊，覃　妍，范文哲

（1.桂林理工大学广西环境污染控制理论与技术重点实验室，广西桂林541004；2.桂林理工大学广西岩溶地区水污染控制与用水安全保障协同创新中心，广西桂林541004）



地衣芽孢杆菌降解茶皂素的研究

黄浦1，2，肖瑜1，2＊，覃妍1，2，范文哲1，2

（1.桂林理工大学广西环境污染控制理论与技术重点实验室，广西桂林541004；
2.桂林理工大学广西岩溶地区水污染控制与用水安全保障协同创新中心，广西桂林541004）

摘 要：以茶皂素（tea saponin）为原料，以茶皂素降解率为指标，利用地衣芽孢杆菌降解茶皂素.分别探讨发酵时间、发酵温度、摇床转速、接种量对其降解的影响，再通过响应曲面设计实验对发酵条件进行优化.结果表明，影响降解率显著性次序为：发酵温度（X2）＞接种量（X4）＞发酵时间（X1）＞摇床转速（X3），得到最佳的优化条件为：发酵时间10.9d，发酵温度28.89℃，摇床转速150r·min-1，接种量为9.11%.在此条件下发酵茶皂素的降解率达到了（63.83±0.28）%.

关键词：茶皂素；地衣芽孢杆菌；液态发酵；响应曲面分析

油茶是中国特有的一种山茶科山茶属植物，主要分布于湖南、江西和广西等南方地区［1］.油茶粕是油茶榨取茶油后的副产物，其中含有丰富的蛋白质、糖类、粗纤维及矿物质［2］；油茶茶枯中富含Mg、Fe、Ca、Mn、Zn、Cu等多种无机微量元素.但是，茶枯中的茶皂素（含量10%～15%），具有辛辣、刺鼻的特性，还具有鱼毒和溶血作用，极大程度地降低了油茶粕作为饲料使用的利用率.

茶皂素（tea saponin）属于五环三萜类皂甙，分子式为C57H90O26，相对分子质量为1 203，熔点为223～224℃，表面张力为47～51Mn·m-1［3］，由甙元、糖和有机酸3部分组成，是一种非离子型极性物质，茶皂素纯品为白色微细柱状晶体，吸湿性强，难溶于冷水、无水甲醇、无水乙醇，不溶于乙醚、丙酮、苯、石油醚等有机溶剂，稍溶于温水、二硫化碳和醋酸乙酯，易溶于含水甲醇、含水乙醇、正丁醇及冰醋酸、醋酐和吡啶［4］.

地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）是一种土壤中常见的细菌，是一类需氧或兼性厌氧的革兰氏阳性细菌，细胞大小为0.8μm×（1.5～3.5）μm，细胞形态和排列呈杆状、单身.

地衣芽孢杆菌是被我国农业部公布允许使用的饲料级微生物添加剂，它在一定条件下能产生抗逆性内生孢子，可产生脂肽类、肽类、磷脂类、多烯类和氨基酸类等多种抗生素，还可以产生各种酶类，如蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶等［5］，并且具有易培养、繁殖快、易保存、对环境适应性强、无毒无污染等特点.董尚智等［6］研究表明，地衣芽孢杆菌具有良好的饲料学特性，是一种优良的益生菌菌株.周振峰［7］研究表明，在奶牛饲料中添加地衣芽孢杆菌制剂能增强奶牛抵抗热应激的能力，并能够起到抗病的作用.刘波等［8］实验研究表明，在银鲫饲料中添加地衣芽孢杆菌，可以促进鱼体生长.

该研究采用枯草芽孢杆菌对茶皂素进行液态摇床培养，以茶皂素降解率为评价指标，通过培养时间、培养温度、摇床转速及菌种接种量的单因子实验研究得出最优降解条件，并通过GCMS对发酵产物进行分析.

1　材料和仪器

1.1 菌 种

地衣芽孢杆菌GIM1.362（Bacillus licheniformis）购买于广东省微生物研究所菌种保藏中心.

1.2 原料与培养基

茶皂素，纯度在98%以上，购于长沙哈根生物科技有限公司.

斜面培养基：蛋白胨（5g·L-1），牛肉膏（3g·L-1），氯化钠（5g·L-1），琼脂（20g·L-1），pH自然.

发酵培养基：茶皂素（2g·L-1），尿素（2g·L-1），磷酸二氢钾（3g·L-1），磷酸氢二钾（6g· L-1），硫酸镁（1g·L-1），硫酸锰（0.2g·L-1），pH自然.

1.3 主要仪器及设备

Clarus 680气相色谱质谱联用仪，美国PE公司；Agilent Technologies 1260Infinity高效液相色谱，美国安捷伦公司；Dragonlab 1 000μL移液枪，大龙仪器有限公司；SH ZB水浴恒温振荡器，上海安亭科学仪器厂；TGL18000cR高速台式冷冻离心机，上海安亭科学仪器厂；AR224CN电子分析天平，奥豪斯仪器（上海）有限公司；SNGJ2FD洁净工作台，上海博讯实业有限公司医疗设备厂；LTFG通风柜，深圳市利龙湖实业有限公司；YXQLS70A立式压力蒸汽灭菌锅，上海博迅实业有限公司.

1.4 主要化学试剂

甲醇，色谱纯，国药集团化学试剂有限公司；蛋白胨，分析纯，北京陆桥技术有限责任公司；尿素、硫酸锰、硫酸镁、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、氯化钠、琼脂粉，分析纯，西陇化工股份有限公司.

2　实验方法

2.1 茶皂素标品标准曲线的制定

准确称取2.5g茶皂素标准品，定容于250mL的容量瓶中，为10mg·mL-1标准液，准确量取0.4、0.8、1.2、1.6、2.0mL标准液于10mL的比色管中，分别用甲醇（色谱纯）定溶至刻度线，摇匀，用注射器抽取一定量液体，过0.45μm的针头过滤器，注入1.5mL液相进样瓶中，最终用高效液相色谱仪进行测定，高效液相色谱洗脱方式为纯甲醇以0.5mL·min-1的速度洗脱，进样量为2μL，柱箱温度30℃，检测波长218nm.当标准方差达到0.999以上为合格，如图1所示.

图1　茶皂素的标准曲线Fig.1　Tea saponin standard curve

2.2 地衣芽孢杆菌菌悬液的制备

用压力蒸汽灭菌锅灭菌250mL超纯水，2个250 mL的广口锥形瓶，于121℃高温下灭菌30min，将灭菌过后的无菌水及锥形瓶放在洁净工作台上，紫外杀菌30min，冷却至室温，再倒入少量无菌水于斜面培养基中，用涂布棒轻轻将地衣芽孢杆菌的菌落撮取下来，倒入到250mL广口锥形瓶中，放入到25℃，150r·min-1的水浴恒温振荡器中回旋振荡30min，再用棉花挡住瓶口，过滤到另一灭菌后的250mL广口锥形瓶中，最后放入到冷藏柜中保存备用.制得菌悬液浓度约106cfu·mL-1.

2.3 地衣芽孢杆菌降解茶皂素单因子实验设定

根据微生物发酵环境的差异，分别考察发酵时间、发酵温度、摇床转速及接种量等单因子对地衣芽孢杆菌降解茶皂素的影响，来确定发酵的最佳范围，为后续实验提供依据.

2.4 响应曲面实验设计

首先用Minitab16中的Plackett-Burman软件进行影响发酵显著因子的筛选，确定影响较大的单因素之后，选取3个显著因素，再用Box-Behnken设计曲面响应面实验.

3　结果与分析

3.1 时间对地衣芽孢杆菌降解茶皂素的影响

由图2可知，发酵前2天的时候，由于微生物进入新的环境要经过调整期，以适应新的环境，导致降解率比较低，随着发酵时间的延长，茶皂素的降解率不断升高，到第11天的时候，对茶皂素的降解效果已经非常明显，此时地衣芽孢杆菌生长达到稳定期，再延长发酵时间，茶皂素降解效果变化不明显，因而得出，茶皂素的最佳发酵时间为11d.

3.2 温度对地衣芽孢杆菌降解茶皂素的影响

由图3可知，随着温度的不断升高，茶皂素降解率呈现出由低到高再到低的趋势，在29℃时，降解率达到最大，此时的地衣芽孢杆菌活性最大，为其发酵的最佳发酵温度；温度较高或者较低时，茶皂素降解不理想，主要是因为高温或者低温度影响了酶的活性，不利于地衣芽孢杆菌对茶皂素的降解.

图2　时间对茶皂素降解的影响Fig.2　Time influence on the degradation of tea saponin

图3　温度对茶皂素降解的影响Fig.3　Temperature influence on the degradation of tea saponin

3.3 转速对地衣芽孢杆菌降解茶皂素的影响

由图4可知，随着摇床转速的增大，茶皂素的降解率呈现出一种由低到高再到低趋势，因地衣芽孢杆菌是好氧菌，溶解氧的多少对其新陈代谢有着决定性作用.当转速过低时，发酵液中溶解氧过少，，不利于微生物的生长代谢，从而导致茶皂素的降解偏低；当转速过高，溶解氧含量过高时，可能是过高的氧会转化成超氧化物基O2-和过氧化物基O22-或羟基自由基OH-，破坏微生物细胞组分，或者是过高的转速不利于菌胶团的形成，从而影响到茶皂素的降解，得到最佳的转速为150r·min-1.

3.4 接种量对地衣芽孢杆菌降解茶皂素的影响

由图5可知，随着地衣芽孢杆菌接种量的增加，茶皂素降解率呈现出由低到高再到低的趋势，当接种量为9%时，降解效果最好，茶皂素降解率达到了63.83%；当接种量低于9%时，随着接种量的增加，降解率变化较大，主要是充足的营养提供菌体大量的生长繁殖；接种量超过9%后，由于大量的微生物共存，微生物之间产生了大量的代谢产物，出现了相互竞争的关系，激烈的相互竞争不利于微生物生长，从而导致降解率降低.

图4　转速对茶皂素降解的影响Fig.4　Rotate speed influence on the degradation of tea saponin

图5　接种量对茶皂素降解的影响Fig.5　Inoculum size influence on the degradation of tea saponin

3.5 响应曲面实验结果与分析

3.5.1 Plackett-Burman设计实验

通过单因子实验所得的最适培养条件，选取培养时间（X1）、培养温度（X2）、摇床转速（X3）、接种量（X4）作为变量，以茶皂素的降解率（Y）作为响应值.通过Minitab16软件设计Plackett-Burman实验，筛选出显著单因子.实验因素水平编码表及Plackett-Burman设计如表1～2所示.

将表2的结果通过Mintabl16软件进行数据分析处理，得到影响地衣芽孢杆菌生物降解的显著因素为：X2＞X4＞X1＞X3，置信度R2＝95.18%，因而选取发酵时间（X1）、发酵温度（X2）及接种量（X4）来进行进一步实验.

表1　Plackett-Burman实验设计因素水平编码表Tab.1　Plackett-Burman experimental design factors level code table

表2　Plackett-Burman实验设计及结果Tab.2　Plackett-Burman experimental design and results

3.5.2 Box-Behnken Design设计实验

根据3.5.1的实验结果，选取发酵时间（X1）、发酵温度（X2）及接种量（X4）3个显著因素，以茶皂素降解率（Y）作为降解指标进行优化实验.每个因素设定3个水平以（-1、0、1）为编码，如表3所示.

表3　Box-Behnken设计实验因素及水平Tab.3　Box-Behnken design experimental factors and levels

表4　Box-Behnken实验设计及结果Tab.4　Box-Behnken experimental design and results

根据表4中的数据分析，可以得到以下的三元二次方程式

通过对回归方程的求解得到地衣芽孢杆菌发酵茶皂素的最佳发酵条件为：发酵时间10.9d，发酵温度28.89℃，摇床转速150r·min-1，接种量为9.11%.模型极显著（P＜0.001），因变量与自变量之间线性关系显著（R2＝99.29%），拟合程度较好（Radj2＝98.39%），表明该实验所选用模型高度显著.在最佳的条件下进行实验，茶皂素的降解率为（63.83±0.28）%，与理论值64.55%很接近，说明此模型能够很好地预测地衣芽孢杆菌降解茶皂素的降解效果.根据实验结果得到响应面图和等高线图，如图6～8所示.

图6　y=f（X1，X2）响应面曲面图和相应的等高线图Fig.6　3Danalysis chart and contour man of y=f（X1，X2）

由图6可知，发酵温度计发酵时间对茶皂素的降解率变化范围较明显，发酵温度在28.89℃、发酵时间在10.9d时降解效果最理想.等高线间距较小，说明发酵时间和发酵温度对茶皂素的降解影响比较大.

图7　y=f（X1，X4）响应面曲面图和相应的等高线图Fig.7　3Danalysis chart and contour man of y=f（X1，X4）

由图7可知，发酵时间（X1）对茶皂素降解率的影响比接种量（X4）大，等高线间距比较小且闭合，说明发酵时间和接种量是影响茶皂素降解的重要因素.

图8　y=（X2，X4）响应面曲面图和相应的等高线图Fig.8　3Danalysis chart and contour man of y=f（X2，X4）

由图8可知，发酵温度（X2）对茶皂素降解率的影响比接种量（X4）大，等高线闭合且密集，说明发酵温度和接种量对茶皂素降解率影响明显.

4　结束语

茶皂素是影响油茶粕作为饲料使用利用率低的主要障碍，作者利用地衣芽孢杆菌来降解茶皂素，具有工艺简单、节约成本、无二次污染的特点；利用地衣芽孢杆菌液态发酵降解茶皂得到的最佳发酵条件为：发酵时间10.9d，发酵温度28.89℃，摇床转速150r·min-1，接种量为9.11%，在此条件下，茶皂素的降解率能够达到了（63.83±0.28）%，实际降解率与理论降解率很接近，说明此模型能够很好地预测茶皂素的降解率，说明地衣芽孢杆菌液态发酵降解茶皂素具有重要的现实意义.

参考文献：

［1］ 聂海瑜.油茶籽的综合利用［J］.粮油加工，2004（6）：39-41.

［2］ 周浩宇，黄凤洪，钮琰星，等.发酵法与化学法改良油茶籽粕品质效果的比较［J］.中国油脂，2010（9）：40-43.

［3］ 江和源，张建勇，高晴晴.茶皂素的性质、制备与应用［J］.中国茶叶，2007，3：13-15.

［4］ 张星海，杨贤强.茶皂素性质及应用研究近况［J］.福建茶叶，2003，2：17-19.

［5］ 蒙显英，黎起秦，冯家勋，等.芽孢杆菌产生的抗菌物质的研究进展［J］.中国植保导刊，2004，12：13-15.

［6］ 董尚智，王国霞，陈远凤，等.饲用地衣芽孢杆菌的生物学特性研究［J］.饲料添加剂，2009，7（5）：15-18.

［7］ 周振峰.地衣芽孢杆菌对牛奶泌乳性能的影响［J］.中国奶牛，2006（5）：13-14.

［8］ 刘波，刘文斌，王恬.地衣芽孢杆菌在异育银鲫日粮中的应用［J］.湛江海洋大学学报（自然科学），2005，25 （6）：31-35.

（责任编辑 于 敏）

Study on the degradation of tea saponin by Bacillus licheniformis

HUANG Pu1，2，XIAO Yu1，2＊，QIN Yan1，2，FAN Wenzhe1，2
（1.Guangxi Key Laboratory of Environmental Pollution Control Theory and Technology，Guilin University of Technology，Guilin 541004，China；2.Guangxi Collaborative Innovation Center for Water Pollution Control and Water Safety in Karst Area，Guilin University of Technology，Guilin 541004，China）

Abstract：Using tea saponin as raw material，with tea saponin degradation rate as the evaluation index，tea saponin was degraded by Bacillus licheniformis.Fermentation time，fermentation temperature，rotation speed and inoculum size on its degradation were explored，again through the response surface design experiments the fermentation conditions were optimized.The results showed that，the order of four kinds of factors significantly impacting the fermentation of Bacillus licheniformis as follows：fermentation temperature （X2）＞inoculation size（X4）＞fermentation time（X1）＞rotation speed（X3）.The optimum fermentation degradation conditions were studied as：fermentation time 10.9d，fermentation temperature 28.89℃，rotating speed 150r·min-1and inoculum size 9.11%，the degradation of tea saponin rate reached（63.83±0.28）%.

Key words：tea saponin；Bacillus licheniformis；liquid fermentation；response surface analysis

doi：10.3969／j.issn.1000-2162.2016.01.015

作者简介：黄 浦（1989-），男，重庆人，桂林理工大学硕士研究生；＊肖 瑜（通信作者），桂林理工大学教授，博士，E-mail：1474237310＠qq.com.

基金项目：国家自然科学基金资助项目（21367010）；广西矿冶与环境科学实验中心，广西危险废物处置产业化人才小高地资助项目

收稿日期：2015-03-28

中图分类号：O156

文献标志码：A

文章编号：1000-2162（2016）01-0091-07