藏药四味辣根菜汤散对大鼠心肌缺血再灌注损伤的保护作用

保善录， 陈湘宏， 李永芳， 段雅彬， 热增才旦， 姚星辰， 孙 娟， 王津慧

（青海大学医学院，青海西宁810001）



藏药四味辣根菜汤散对大鼠心肌缺血再灌注损伤的保护作用

保善录， 陈湘宏， 李永芳， 段雅彬， 热增才旦， 姚星辰， 孙 娟， 王津慧*

（青海大学医学院，青海西宁810001）

摘要:目的 探讨藏药四味辣根菜汤散对大鼠心肌缺血再灌注损伤的保护作用。方法 48只SPF级Wistar雄性大鼠随机分为假手术组，缺血再灌注模型组，阳性丹参［1.75 g/（kg·d）］组，四味辣根菜汤散低［0.7 g/（kg·d）］、中［1.4 g/（kg·d）］、高［2.1 g/（kg·d）］剂量组。灌胃给药10 d后采用结扎大鼠左冠状动脉前降支方法制备心肌缺血再灌注模型，缺血30 min，再灌注90 min。假手术组只穿线不结扎左冠状动脉。并观察大鼠心电图的变化。再灌注末腹主动脉取血，检测血清中肌酸激酶（CK）和乳酸脱氢酶（LDH）活性，肌钙蛋白1（cTn1）的量，丙二醛（MDA）的量，超氧化物歧化酶（SOD）和谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）活力，透射电镜观察左心室形态。结果与模型组比较，四味辣根菜汤散给药组能降低大鼠血CK、LDH的释放（P＜0.05），降低cTn1水平（P＜0.05），可升高SOD（P＜0.05），降低MDA的量（P＜0.05），藏药四味辣根菜汤散高、中剂量组能明显减轻缺血再灌注损伤区域心肌超微结构线粒体的形态。结论 四味辣根菜汤散对大鼠缺血再灌注损伤的心肌具有保护作用。

关键词:四味辣根菜汤散；心肌缺血再灌注；清除自由基；线粒体

dol:10.3969/j.issn.1001-1528.2016.02.039

由于高寒缺氧，血液黏稠度高，加之饮食结构不合理，心肌缺血疾病在青藏高原地区多发。因此冠脉内溶栓术、冠脉内球囊扩张血管成形术及体外循环心内直视手术等手术成为首选。但冠状动脉再通后易造成缺血再灌注损伤，所以心肌缺血再灌注损伤日益受到重视，藏药四味辣根菜汤散在改善心肌缺血，预防治疗再灌注损伤显示出重要的作用［1］。藏药四味辣根菜汤散系传统藏成药，藏药名为索洛西汤，由高山辣根菜、紫草茸、狭叶红景天、甘草组成。藏医经典著作中对其功效的记载为:清热滋阴、凉血止血。主要用于治疗发烧、气短、目赤、唇舌及腮颊均发紫绀、喉堵声不扬、上体腔胀满、呼吸喘急、咯吐血痰为主的胸腔内恶血泛、心肺肿胀等症状［2-4］。本研究主要通过现代药理实验方法进一步证实并探讨其可能的作用机制，为藏药四味辣根菜汤散的临床应用提供理论依据。

1 材料

1.1 药品 四味辣根菜汤散由青海省藏医院制剂科提供，批号20130607；丹参由毫州市远光中药饮片厂生产，批号20140701。

1.2 试剂 检测所用的试剂盒全部购自于南京建成生物工程研究所，包括CK（肌酸激酶），批号20141217；LDH（乳酸脱氢酶），批号20141218；SOD（超氧化物歧化酶），批号20141204；MDA（丙二醛），批号20141207；GSH-Px（谷胱甘肽过氧化物酶），批号20141205；cTn1（肌钙蛋白1），批号20141203。

1.3 仪器 BL-420S生物机能实验系统（成都泰盟科技有限公司）；HX-300S动物呼吸机（成都泰盟科技有限公司）；DNW-9602酶标分析仪（北京普朗新技术有限公司）；UV-2550紫外分光光度计（日本岛津公司）；H-600IV型透射电镜，（日本日立公司）；80-2离心机（上海光学仪器厂）；自制气管玻璃插管；自制0.8 mm硅胶管。

1.4 动物 Wistar雄性大鼠，SPF级，8周龄，体质量（240±20）g，购于兰州大学实验动物中心，合格证号: SCXK（甘）2013-0002；在青海大学医学院实验动物中心分笼饲养，每笼8只；自由饮水，自由食大鼠维持饲料；室温（23±2）℃，光照明暗12 h交替；适应性喂养3 d。

2 方法

2.1 药物提取 将四味辣根菜汤散加水浸泡2 h，煎煮2 h，过滤，加水重复上述过程3次，合并3次煎煮液、过滤、浓缩至50％（相当于生药0.5 g/mL）；丹参水提液制备方法同四味辣根菜汤散水提液；4℃避光保存备用。

2.2 动物分组 48只大鼠随机分为6组:四味辣根菜汤散高、中、低剂量组，阳性丹参对照组，缺血再灌注模型组及假手术组。

2.3 动物给药 四味辣根菜汤散成人（60 kg）的剂量为每次4 g［即0.13 g/（kg·d）］，2次/d。低、中、高剂量组分别于成人剂量的5、10、15倍［大概为0.7、1.4和2.1 g/（kg·d）］，阳性对照组给予丹参1.75 g/（kg·d）。假手术组和模型组灌胃等容积生理盐水，剂量为2 mm×2 mm），并用3％戊二醛预固定，1％四氧化锇再固定，丙酮逐级脱水，EPon812包埋，半薄切片光学定位，超薄切片，醋酸铀及橼酸铅双重染色，日立H-600IV型透射电镜观察并拍照。

2.6 统计学分析 对数据进行统计处理选用SPASS 17.0软件，检测数据都以均数±标准差（±s）的格式表示，多组之间的比较，用单因素ANOVA方差分析，两两组间的比较，用LSD方法，检验水准α=0.05。 1.4 g/（kg·d）。各组灌胃1次/d，连续10 d。

2.4 缺血再灌注模型制备 （1）Wistar大鼠术前禁食6 h［5］，20％乌拉坦按5 mL/kg对大鼠实施腹腔注射麻醉，仰卧位固定，打开电脑及BL-420S生物机能实验信号采集系统，连接心电图，记录Ⅱ导联心电图［6］。（2）自制玻璃气管插管连接小动物呼吸机，进行机械通气。（3）在胸骨左缘0.5 cm处剪开胸部皮肤，于2～4肋间剪断第3、4肋并分离肋间肌，剪开胸膜，使心脏充分暴露，分离开心包膜。于左心耳与肺动脉圆锥交界处下约3～4 cm处进针深度为1.0～1.5 mm，宽度为2～3 mm，穿5-0非吸收性缝合线结扎左冠状动脉左前降支，适应5 min，然后在结扎线与冠状动脉之间放置一根直径约0.8 mm，长约1 cm的聚乙烯管，通过拉紧结扎线，迫使聚乙烯管压迫于冠状动脉之上，从而引起冠脉闭塞，造成急性心肌缺血模型。（4）以同步心电图QRS波群增高、增宽、ST段抬高为结扎成功标志［7］。（5）缺血30 min后用眼科剪剪断聚乙烯管及结扎线进行再灌注，以心脏表面颜色转红、抬高的S-T段下降在1/2以上为再灌注成功标志，再灌注90 min［8-9］。假手术组的动物手术过程与模型组相同，但只穿线不结扎左冠状动脉。

2.5 指标检测

2.5.1 血清指标测定 再灌注末立即行腹主动脉取血5 mL以上，4 000 r/min离心10 min，取上清液-80℃冰箱冷藏备用。CK、LDH用微量酶标法，MDA用TBA法，SOD用WST-1法，GSH-Px和1cTn1用酶标法。严格规范各检测程序。

2.5.2 组织观察 随机摘取各组4只大鼠心脏，迅速切取左心室与心尖部中点左心室前壁小块心肌（体积为2 mm×

3 结果

3.1 对大鼠血清中CK和LDH活性的影响 结果见表1，模型组大鼠血清CK和LDH释放明显多于假手术组（P＜0.01）。四味辣根菜汤散各剂量组与模型组比较，血清中CK和LDH的释放明显减少（P＜0.05）。

表1　各组大鼠血清CK和LDH活力比较（±s）

表1　各组大鼠血清CK和LDH活力比较（±s）

注:与模型组比较，▲P＜0.01，△P＜0.05

组别　n CK/（U·L-1）LDH/（U·L-1）假手术组　8 1.110±0.107▲862.33±30.56▲模型组　8 1.645±0.187 1 441.93±49.98阳性丹参组　8 0.705±0.195▲1 137.78±23.05▲四味辣根菜汤散高剂量组　8 1.234±0.127▲1 048.98±23.56▲四味辣根菜汤散中剂量组　8 1.351±0.199△1 236.46±41.38△四味辣根菜汤散低剂量组　8 1.383±0.101△1 340.42±42.62△

表2　各组大鼠血清中S 0 D、GSH-Px活力和MDA含有量比较（±s）

表2　各组大鼠血清中S 0 D、GSH-Px活力和MDA含有量比较（±s）

注:与模型组比较，▲P＜0.01，△P＜0.05

组别　n　SOD/（U·mL-1）　GSH-Px/（μmo1·L-1）　MDA/（μmo1·L-1）假手术组　8　449.03±22.69▲　3 291.93±51.40　1.92±0.72▲模型组　8　160.24±29.96　3 450.12±26.10　10.56±1.10阳性丹参组　8　332.05±23.87▲　3 022.61±52.89　5.21±0.95▲四味辣根菜汤散高剂量组　8　385.91±14.41▲　3 348.86±53.98　6.10±1.56▲四味辣根菜汤散中剂量组　8　371.79±13.00▲　3 039.26±51.89　7.25±1.86▲四味辣根菜汤散低剂量组　8　243.75±23.01▲　3 112.18±36.88　9.08±1.84△

3.2 对大鼠血清SOD、GSH-Px活性和MDA的量的影响结果见表2，模型组大鼠血清SOD的活性低于假手术组，MDA含有量增高（P＜0.01）。四味辣根菜汤散高、中、低剂量组与模型组比较，各组均能增加血清中超氧化物歧化酶SOD的活性，降低MDA的量（P＜0.05）。各组GSH-Px的活性无统计学意义。

3.3 对大鼠血清cTn1含有量的影响 结果见表3，大鼠血清cTn1的量明显高于假手术组（P＜0.01）。四味辣根菜汤散高、中、低剂量组与模型组比较，均能减少血清中cTn1的量（P＜0.05）。

表3　各组大鼠血清c T n 1含有量比较（±s）

表3　各组大鼠血清c T n 1含有量比较（±s）

注:与模型组比较，▲P＜0.01，△P＜0.05

组别　n　cTn1/（Pg·mL-1）假手术组　8　158.53±10.06▲模型组　8　223.91±12.48阳性丹参组　8　127.06±9.60▲四味辣根菜汤散高剂量组　8　183.57±10.64▲四味辣根菜汤散中剂量组　8　183.59±11.30▲四味辣根菜汤散低剂量组　8　176.64±9.69▲

3.4 对大鼠心脏左心室组织进行超微结构形态学观察 如图1所示，阳性丹参药物组与藏药四味辣根菜汤散高、中药物组效果佳。图1A假手术组:平滑肌纤维整齐，细胞核染色质散布均匀，线粒体结构清晰，个别线粒体有轻度肿胀TEM（透射电镜）（10×103倍）。图1B缺血再灌注模型组:可见平滑肌纤维排列紊乱，细胞核染色质有固缩，细胞中大量线粒体肿胀，线粒体嵴变短、消失或变空（TEM，5×103倍）。图1C丹参阳性对照组:平滑肌纤维整齐，细胞核染色质分布均匀，线粒体结构清晰（TEM，8×103倍）。图1D藏药四味辣根菜汤散高剂量组:平滑肌纤维排列整齐，细胞核染色质分布均称，线粒体结构清晰（TEM，10×103倍）。图1E藏药四味辣根菜汤散中剂量组:心脏平滑肌纤维排列整齐，胞核染色质分布均匀，线粒体结构清晰（TEM，10×103倍）。图1F藏药四味辣根菜汤散低剂量组:平滑肌纤维排列整齐，胞核染色质分布均匀，线粒体结构清晰，个别心肌细胞核染色质有固缩（TEM，10×103倍）。

图1　各组大鼠心肌组织透射电镜观察图

4 讨论

手术治疗心肌缺血疾病的过程中心肌缺血再灌注损伤（ischemia rePerfusion injury，IRI）的危害表现尤为突出。而藏药四味辣根菜汤散在藏医临床上，广泛应用于心肌缺血的疾病中。鉴于此，本实验首先比较了模型组、假手术组和藏药四味辣根菜汤散各组之间CK、LDH和cTn1的变化。因为CK与细胞内的能量运转、再生以及平滑肌收缩都有着直接关系，其可逆地催化肌酸与ATP之间的转磷酰基反应，对诊断急性心肌梗死有较高价值［10］，LDH是一种糖酵解酶，可催化丙酮酸生成乳酸［11］。实验组即藏药四味辣根菜汤散高、中、低剂量组与模型组比较，血清中CK和LDH酶的漏出明显减少，说明四味辣根菜汤散能够明显抑制肌酸与ATP之间的转磷酰基反应，减缓LDH催化丙酮酸生成乳酸，从而改善心脏平滑肌的收缩功能。cTn1在体内的表现形式有两种，一是约有3％的cTn1游离于细胞质浆中，二是大部分cTn1与心肌结构蛋白结合，固定于肌原纤维上，当心肌细胞膜未遭破坏时，cTn1是不能透过细胞膜进入到血循环当中的［12-13］，这也正是在假手术组大鼠血清检测过程中cTn1的量是很少的原因。但是，若因缺血、缺氧造成心肌细胞出现损伤时，游离状态的cTn1首先释放入血，随着心肌细胞的不断坏死、崩解和细胞结构的破坏，结合状态的cTn1会持续释放入血，而实验中藏药四味辣根菜汤散组血清中cTn1的水平明显低于模型组，说明藏药四味辣根菜汤散可以抑制缺血再灌注对心肌细胞的损伤，减轻细胞结构的的破坏及坏死程度，从而使cTn1释放入血的量明显降低。

心肌细胞中的线粒体（mitochondrion）是给心肌制造能量的结构，被称为“Power house”。缺血再灌注引起的损伤与线粒体结构的完整性关系密切，所以心肌线粒体结构的好坏是评价药物是否有效的最有力、直接证据［14］。本实验通过超微结构显示心肌缺血再灌注后线粒体发生的改变，并与模型组对比，看出藏药四味辣根菜汤散高、中剂量组大鼠心脏平滑肌肌纤维排列较整齐，细胞核染色质分布亦均匀，线粒体结构大体完整，与假手术组大鼠心脏平滑肌纤维和线粒体结构基本一致，说明藏药四味辣根菜汤散可以保护心肌肌纤维和线粒体的完整性。各组大鼠心肌超微结构的相互比较证明本次心肌缺血再灌注损伤模型的成功和藏药四味辣根菜汤散对心肌缺血再灌注损伤大鼠有效。

藏药四味辣根菜汤散高、中、低剂量灌胃给药后，大鼠血清中SOD的活性与模型组比较均明显提高，而MDA的量与模型组比较则显著降低。这一结果充分说明藏药四味辣根菜汤散可以抑制心肌因缺血再灌注损伤引起自由基的大量产生，增强自由基清除剂SOD的活性，从而使机体氧化与抗氧化系统保持相对的平衡［15］；另外，藏药四味辣根菜汤散换可抑制生物膜上的不饱和脂肪酸发生脂质过氧化、降低氧化产物MDA对细胞膜的攻击、减轻其受损程度［16］，达到对心肌细胞的保护作用。

GSH-Px通过催化还原型谷胱甘肽对过氧化氢的还原反应，起保护心脏平滑肌细胞膜结构完整及功能正常的作用［17-18］。通过对给药组GSH-Px的活力检测与模型组相比有降低，但无统计学意义，说明藏药四味辣根菜汤散通过催化过氧化氢分解酶这一途径干预心肌缺血再灌注损伤的作用是比较微弱的。

以上几个心肌酶指标，抗缺氧和抗氧化指标及心肌肌纤维和线粒体超微结构表明，藏药四味辣根菜汤散对缺血再灌注损伤心肌的保护作用可能是通过促进抑制自由基的产生、增强自由基清除剂的功能、维持心肌细胞氧化和抗氧化的动态平衡、保护心肌线粒体结构的完整性，在损伤时增强其氧化磷酸化能力，从而达到对大鼠心肌缺血再灌注损伤的保护作用。但藏药四味辣根菜汤散干预的具体有效过程及信号传导通路有待进一步研究。

参考文献:

［1］ 王开国.关于冠心病起因及预防的中医学解说［J］.人人健康:医学导刊，2007（10）: 58-60.

［2］ 宁妥·云丹贡布.四部医典［M］.西安:陕西师范大学出版社，2006.

［3］ 杨永昌.藏药志［M］.西宁:青海人民出版社，1991.

［4］ 西藏，青海，四川，甘肃，云南，新疆卫生局.藏药标准［S］.西宁:青海人民出版社，1978.

［5］ 郑曙云，徐建国.参附注射液对大鼠心肌缺血再灌注损伤的影响［J］.中国中西医结合杂志，2004，24（6）: 541-548.

［6］ 杨 梅，寇毅英，冯伟力，等.三味檀香散对大鼠心肌缺血损伤的保护作用及机制［J］.中国药理学通报，2008，24（4）: 485-488.

［7］ 李永芳，寇毅英，杨 梅，等.八味沉香散对异丙肾上腺素诱导心肌缺血损伤大鼠抗氧化作用［J］.中国现代应用药学，2008，25（6）487-490.

［8］ 王淑侠，王小莉.大鼠缺血再灌注损伤模型的改进与评价［J］.解剖科学进展，2000，6（4）: 371-372.

［9］ 刘艳伟，刘水平.大鼠心肌缺血再灌注模型的改进及心电图判断指标［J］.实用儿科临床杂志，2007，4（7）: 525-527.

［10］ Kato R，Foex P.Myocardia1Protection by anesthetic agents A-gainst ischemia-rePerfusioninjury: an uPdate for anesthesio1ogists［J］.Can JAnaesth，2002，49（8）: 777-791.

［11］ Ho11 M，Donat H，Weise W.PeriPhera1 b1ood 1ymPhocyte subPoPu1ations of PostmenoPausa1women with hormone reP1acement theraPy［J］. Zentralbl Gynakol，2001，123（9）: 543-546.

［12］ 冯品宁，刘 敏，崔颖鹏，等.心肌肌钙蛋白T、肌钙蛋白I及CK-MB诊断急性心肌梗死临床应用价值的比较分析［J］.中国实验诊断学，2008，12（10）: 1256-1258.

［13］ 梁 伟，易伟莲.心肌酶谱和肌钙蛋白1联合检测对诊断急性心肌梗死的临床应用价值［J］.临床研究，2014，17 （12）: 38-39.

［14］ 吕 磊，徐 军.心肌缺血再灌注损伤中线粒体保护的研究进展［J］.东南大学学报:医学版，2015，2（34）: 131-134.

［15］ 廖日滔，饶平凡.自由基相关细胞信号传导的研究进展［J］.中国细胞生物学学报，2014，36（11）: 1573-1583.

［16］ 房江山，孟新玲，刘远新.金莲花总黄酮对大鼠心肌缺血再灌注损伤的保护作用［J］.重庆医科大学学报，2014，39（10）: 110-114.

［17］ 闵 清，白育庭，张 志，等.山楂叶总黄酮对大鼠心肌缺血再灌注损伤的心电图、一氧化氮及丙二醛变化的影响［J］.中国临床药理学与治疗学，2007，12（7）: 800-802.

［18］ 邵 莹，吴启南，周 婧，等.淡竹叶黄酮对大鼠心肌缺血/再灌注损伤的保护作用［J］.中国药理学通报，2013，29（2）: 241-246.

*通信作者:王津慧（1959-），女，教授，从事中藏药药理研究。Te1:（0971）6105910，E-mai1: qywjh59@163.com

作者简介:保善录（1989-）男，硕士生，从事中藏药药理研究。Te1: 15500545421，E-mai1: 305912664@qq.com

基金项目:青海省自然科学基金资助项目（2011-N-F19）

收稿日期:2015-05-23

中图分类号:R285.5

文献标志码:B

文章编号:1001-1528（2016）02-0415-04