线粒体自噬对心力衰竭的作用及相关中药研究进展

李伟利，王晓平，张雪峰，邵明燕，陈 旭，马 林，张 倩，李 春，王 勇

心力衰竭并不是一个独立的疾病，而是各种心脏疾病(冠心病、高血压及特发性心肌病等)发展的终末阶段，其特征是心脏不能维持足够的血液输出，是目前主要的公共健康问题[1]。由于心脏的高能量需求，线粒体占心肌细胞体积至少30%，线粒体功能障碍导致的能量代谢异常已成为心力衰竭的主要病理机制和干预环节[2]。线粒体自噬在心力衰竭中发挥重要作用，与线粒体动力共同维持着心脏线粒体的更新与质量控制，为心脏持续收缩提供能量[3]。中药通过作用于线粒体自噬治疗心力衰竭的研究在近年来备受关注，相关研究日益增多[4-5]。本研究分析线粒体自噬在心力衰竭中的重要作用，总结线粒体自噬主要参与蛋白分子和信号通路，综述中药通过这些蛋白分子和信号通路治疗心力衰竭的研究进展。

1 自噬与线粒体自噬概述

自噬指真核细胞吞噬自身胞质蛋白或细胞器并使其包被进入囊泡形成自噬体，自噬体进一步与溶酶体融合形成自噬溶酶体，最终降解其所包裹的内容物的过程[6]。生命体借此维持能量代谢平衡及细胞环境稳定，调控细胞的更新和生长发育。另外，有关细胞“自噬作用”的研究于2016年获得了诺贝尔医学/生理学奖。线粒体自噬是细胞特异性并选择性降解线粒体的过程，在心力衰竭情况下有显著改变，因此，线粒体自噬对心力衰竭的作用机制研究受到人们的广泛关注[7]。目前，多数研究集中于受损线粒体被识别吞噬的分子机制。哺乳动物的线粒体自噬识别机制主要依靠两种线粒体膜蛋白标记物[8]，一种是富集于线粒体外膜且介导线粒体蛋白泛素化，从而促进泛素化的线粒体被接头蛋白识别。接头蛋白能够将线粒体上的泛素与吞噬泡上的微管相关蛋白1轻链3(microtubule associated protein 1 light chain 3，LC3)连接，从而促进吞噬泡吞噬降解线粒体。最典型的是PTEN诱导激酶1(PTEN-inducible putative kinase 1，PINK1)/ E3泛素连接酶(parkinson juvenile disease protein 2，Parkin)通路。另一种是功能上作为LC3的受体，与吞噬泡上的LC3结合域(LC3-interacting region，LIR)连接而被吞噬泡识别吞没，包括：NIP3样蛋白X(NIP3-like protein X，Nix)/腺病毒E1B 19 kDa 相互作用蛋白3样(BNIP3L)、腺病毒E1B19 kDa相互作用蛋白3(BNIP3)、FUN14结构域包含蛋白1(FUN14 domain containing 1，FUNDC1)、Bcl2-L-13、抑制素2(PHB2)和心磷脂等。

2 线粒体自噬的分子机制

2.1 PINK1/Parkin介导的线粒体自噬 PINK1和Parkin介导的线粒体自噬是目前哺乳动物中建立最完整、研究最为清楚的机制。PINK1是一种丝氨酸/苏氨酸激酶，其N端有靶向于线粒体的信号。通过外膜转位酶(translocase of the outer membrane，TOM)和内膜转位酶(translocase of the inner membrane，TIM)，PINK1进入并固定于线粒体内膜转位酶上。在未受损线粒体内，PINK1不断地被基质加工蛋白(matrix processing peptidase，MPP)和早老素相关菱形样蛋白(presenilin-associated rhomboid-like，PARL)降解[9-10]。当线粒体受损时(去极化、非折叠蛋白增加等)，PINK1进入线粒体内膜受阻而在线粒体外膜堆积[11]。此时，PINK1与TOM形成700 kDa的复合物，且自磷酸化于丝氨酸228和丝氨酸402位点[12-13]。激活的PINK1募集Parkin至受损线粒体，Parkin进一步介导线粒体外膜蛋白泛素化，促进泛素化的线粒体被接头蛋白识别。接头蛋白将线粒体上的泛素与吞噬泡上的LC3连接，最终吞噬降解线粒体。接头蛋白在线粒体自噬中发挥重要作用，目前报道的有p62、NBR1、optineurin、NDP52和TAX1BP1[14]。PINK1募集并激活Parkin一直都是研究领域的重点，Gladkova等[15]报道了线粒体的磷酸-泛素是Parkin募集的原因，且PINK1不断磷酸化Parkin导致了Parkin的激活。Wang等[16]报道AMP依赖的蛋白激酶α2[adenosine 5′-monophosphate (AMP)-activated protein kinase α2，AMPKα2]磷酸化PINK1丝氨酸495位点，从而增强PINK1的活性。然后，激活的PINK1磷酸化线粒体外膜上的融合蛋白2(mitofusin2，MFN2)，作为Parkin的线粒体受体[17]。也有报道称PINK1介导了线粒体上泛素(包括Parkin泛素样区域)的丝氨酸65位点磷酸化[18-19]，泛素的磷酸化直接激活Parkin而促进线粒体蛋白进一步被Parkin泛素化[20]。然而，也有研究证明在心肌细胞PINK1-/-时，Parkin依然能够被募集激活[21]，说明除PINK1外，存在其他能够激活Parkin从而激活线粒体自噬的通路。因此，有报道称除了上述典型的PINK1/Parkin通路，PINK1和Parkin还参与了其他的线粒体蛋白清除机制。例如，Parkin促进含缬氨酸蛋白(valosin containing protein，VCP)/p97募集至受损线粒体，该酶提取泛素化蛋白用于蛋白酶体降解[22]；Parkin和PINK1还参与运送线粒体源性囊泡(mitochondria-derived vesicles，MDV)至溶酶体降解清除受损线粒体[23]。

2.2 Nix/BNIP3L和BNIP3 BNIP3和BNIP3L/Nix作为多功能的线粒体外膜蛋白，最初被鉴定为促凋亡的BH3-only蛋白。在心肌组织中，BNIP3和Nix的表达分别受到缺氧和Galphaq依赖性信号的调节而促进心肌细胞凋亡，导致心功能下降[24]。然而，BNIP3和Nix最广为人知的是其作为线粒体自噬的调节因子，其可以作为线粒体自噬受体定位于线粒体外膜，通过其LIR与LC3结合，直接将吞噬泡招募至线粒体介导线粒体自噬。Kubli等[25]报道了心脏缺血/再灌注(ischemia/reperfusion，I/R)后，氧化应激诱导BNIP3同源二聚化而激活线粒体自噬。此外，BNIP3和Nix还可能通过破坏Bcl-2和Beclin1的相互作用而直接激活细胞自噬[26]。

2.3 FUNDC1 FUNDC1是一种高度保守的线粒体外膜蛋白，广泛表达于各种细胞、组织和器官，尤其心脏。作为线粒体自噬受体，其通过与LC3相互作用介导线粒体自噬。在正常压力条件下，FUNDC1被SRC激酶和酪蛋白激酶2(casein kinase 2，CK2)磷酸化，降低其对LC3的亲和力。在缺氧和线粒体膜解耦剂处理等应激条件下，FUNDC1被unc-51样自噬激酶(unc-51 like autophagy activating kinase 1，ULK1)对其丝氨酸17位点磷酸化和磷酸甘油酸变位酶5(phosphoglycerate mutase family member 5，PGAM5)对其丝氨酸13位点去磷酸化而激活，增强了其LIR与LC3的结合而促进线粒体自噬[27-28]。因此，在缺氧和线粒体膜解耦剂处理等条件下，线粒体自噬以依赖于FUNDC1的方式发生。Zhang等[29]报道，在缺血/再灌注诱导的低氧条件下，心脏FUNDC1介导的线粒体自噬增加，血小板活性受损，缺血/再灌注的心脏损伤减少。

2.4 Bcl2-L-13 线粒体外膜蛋白Bcl2-L-13是一种酵母自噬相关蛋白32(autophagy-related protein 32，Atg32)的哺乳动物同源物，也可以作为线粒体自噬受体介导线粒体自噬。其能够偶联或通过特定的WXXI功能基序与LC3结合，以一种不依赖于Parkin的方式促进线粒体自噬[30]。此外，Bcl2-L-13还以不依赖于裂变调节剂动力相关蛋白1(dynamin-related protein 1，Drp1)的方式调节线粒体分裂，这主要由其保守的BH结构域促成[30]。Bcl2-L-13对线粒体自噬和分裂的双重作用可能有助于提高清除受损线粒体的协调性和效率性。Murakawa等[31]报道，在哺乳动物中，Bcl2-L-13与ULK1复合物、微管相关蛋白轻链3B(LC3B)结合而促进饥饿诱导的线粒体自噬发生。因此，ULK1复合物在Bcl2-L-13介导的线粒体自噬中起着重要作用。

2.5 心磷脂 心磷脂存在于线粒体内膜，许多研究报道了其作为线粒体自噬、分裂、代谢和凋亡的关键中介者的作用，且对维持心血管健康尤为重要[32]。据报道其在线粒体损伤时转位至线粒体外膜而标记受损线粒体被识别，并与LC3直接相互作用[33]。然而，氧化的心磷脂积累在线粒体外膜会导致促凋亡蛋白Bax的释放，线粒体渗透性转运通道(mitochondria permeability transition pore，MPTP)打开而释放促凋亡因子细胞色素C，最终导致细胞死亡[34]。

2.6 PHB2 最近发现的线粒体自噬受体是PHB2。PHB2虽具有LIR但位于线粒体内膜，通常LC3无法到达，因此，其介导的线粒体自噬依赖于能够导致线粒体外膜(OMM)破裂的OMM蛋白降解机制。例如，Parkin介导的泛素-蛋白酶体降解机制。哺乳动物细胞中，Parkin介导的线粒体自噬也需要PHB2，尤其在应对寡霉素/抗霉素诱导的应激反应时[35]，然而这是否能够延伸到其他应激源还有待确定。

3 线粒体动力对线粒体自噬发生发展的作用

线粒体动力在线粒体质量控制中起着关键作用，研究表明线粒体外膜的Mfn1和Mfn2、内膜的视神经萎缩症蛋白1(optic atrophy 1，Opa1)调控线粒体融合，而Drp1、Fis1和线粒体分裂因子(mitochondria fission factor，MFF)调控线粒体分裂。越来越多的研究表明，线粒体分裂在一定程度上促进线粒体清除，而融合则抑制线粒体自噬。Song等[36]证实了线粒体动力在体内线粒体周转中的重要性，其对小鼠心脏特异性Drp1、融合蛋白1(MFN1)和MFN2敲除，线粒体动力被完全破坏，导致线粒体体量显著增加、肌细胞畸变和心肌肥厚的发生。其中，线粒体的分裂对于分离功能失调的线粒体被自噬清除是非常重要的。在线粒体损伤时，分裂往往会产生不均等的子线粒体，有助于损伤成分与健康的细胞器分离。线粒体分裂可被Drp1调控，在应对压力时，其从胞液转移到线粒体内，从而促进线粒体分裂和自噬[37]。Shirakabe等[38]报道，Drp1下调诱导线粒体融合而抑制线粒体分裂和自噬，从而加重压力诱导的心力衰竭。

4 线粒体自噬的检测

目前，线粒体自噬检测方法主要有透射电镜技术、免疫金标记技术(线粒体和自噬体标记蛋白抗体共定位)、荧光标记基因转染技术(mCherry/mRFP-GFP-LC3、mKeima)、荧光探针标记技术(Mitotracker、LysoTracker)、免疫荧光技术(CypD、Hsp60、Lamp1/2)、免疫印迹技术。然而，大多数方法只适用于体外培养的活细胞检测，体内线粒体自噬检测方法成为线粒体自噬研究领域的一大障碍。最近出现了几种可以监测和量化体内组织线粒体自噬通量的方法：MitoTimer、mt-Keima和mito-QC荧光蛋白转基因技术[39]，这3种荧光蛋白都可以定位于线粒体而准确地测量线粒体自噬活性。MitoTimer是一种对时间敏感的荧光蛋白，在蛋白成熟过程(48 h内)中，其发射的荧光由绿色不可逆转地变为红色，绿色、黄色和红色的线粒体分别对应于新合成的线粒体、中间线粒体和旧线粒体[40]，由不同荧光的比例来反映线粒体的周转率。mt-mKeima和mito-QC都是对pH敏感的线粒体荧光探针。mt-mKeima在酸性和中性条件下分别发射红色和绿色荧光，当线粒体自噬体与酸性溶酶体融合后Keima蛋白的荧光信号由绿色转为红色。mito-QC由串联的mCherry-GFP与线粒体外膜蛋白FIS1序列融合而形成。在稳态条件下，mito-QC呈现红色和绿色荧光，而线粒体被传递到溶酶体时，GFP(绿色)淬灭，mCherry(红色)仍旧稳定[41]。两者都可以用于实时动态监测线粒体自噬过程。有研究通过小鼠颈静脉注射AAV9-Mito-Keima和AAV9-Lamp1-YFP制备了mt-mKeima和Lamp1双转基因小鼠用于实时监测心脏线粒体自噬通量[42]。

5 中药通过线粒体自噬治疗心力衰竭的研究进展

在多种心脏疾病研究中，报道了许多中药活性成分作用于心肌线粒体自噬上游通路或线粒体自噬关键蛋白而调节线粒体自噬，起到心脏保护作用。例如，荭草苷[4]、小檗碱[5]作用于线粒体自噬腺苷酸激活蛋白激酶(AMPK)/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)通路调节自噬平衡而保护心脏；紫荆黄酮通过抑制胞内PI3K/Akt通路而发挥心肌保护作用[43]；针对线粒体自噬中的PINK1/Parkin通路，大蒜辣素[44]、白藜芦醇[45]具有激活作用，而荭草苷具有抑制作用[46]，分别促进心肌线粒体自噬或抑制心肌线粒体自噬过度激活，保护心肌；丹酚酸B[47]、梓醇[48]、人参皂苷[49]等能够促进心肌自噬关键蛋白(LC3、Beclin1、p62)的表达而促进自噬，发挥心肌保护作用；而香青兰总黄酮[50]显著减少心肌自噬关键蛋白的表达而抑制自噬过度激活，同样能够发挥心肌保护作用。总之，根据对自噬的作用，目前研究报道的能够调节自噬发挥心肌保护作用的中药活性成分大致分为两类：促进自噬和抑制自噬。然而无论是促进自噬还是抑制自噬过度激活，这些中药复方或活性成分都能够维持线粒体自噬平衡而发挥心肌保护作用，但其产生促进或抑制作用的药理机制仍需深入研究。

6 小结与展望

本研究通过全面总结分析线粒体自噬的分子机制及其对心脏疾病的作用，为中药治疗心力衰竭提供更多研究环节。线粒体自噬的主要分子机制包括PINK1/Parkin通路和线粒体自噬受体(Nix、BNIP3、FUNDC1、Bcl2-L-13、Cardiolipin、PHB2)介导的线粒体自噬。其中对PINK1/Parkin介导的线粒体清除机制研究最为清楚，涉及典型的PINK1/Parkin通路、泛素-蛋白酶体降解系统和MDV通路等多个机制影响线粒体质量控制。近年来，对线粒体自噬受体的研究日益增多，尤其是在心脏疾病发生及其中药应用的分子机制研究领域。对于线粒体自噬的检测，目前大多数线粒体自噬检测技术只适用于离体培养细胞，可靠的体内线粒体自噬检测方法成为线粒体自噬研究领域的一大障碍，因此，能够监测和量化体内组织线粒体自噬通量的方法与技术亟待开发。许多中药通过作用于AMPK、mTOR、PI3K、Akt等线粒体自噬上游蛋白，调节PINK1、Parkin、LC3、p62、Beclin1等线粒体自噬关键蛋白的表达以控制线粒体质量，对心脏起到潜在的保护作用。以确有疗效的中药为模板，筛选基于线粒体自噬进而改善心肌能量代谢的有效中药/分子，以期为临床心力衰竭的治疗提供新的靶点和潜在的治疗药物。