基于c-ring探讨活血化瘀法经ATP5G1改善心力衰竭的作用机制

孙大伟，冯丽莎，吴晓翠，杨 旭 ，杨 希，索艳荣

心力衰竭(heart failure，HF)是多种原因诱导的心脏结构异常改变，致使心功能发生障碍，从而引起的一组复杂临床综合征，是各种心脏疾病的终末阶段，猝死风险极高[1-2]。虽然现代医学对心力衰竭的发病机制研究较为深入，但是心力衰竭的病理生理机制尚未完全明确，目前认为主要与能量代谢障碍、体液因子的改变、心室重构、细胞大量凋亡、过度自噬、氧化应激、离子缺陷及炎症反应等有关[3-5]。由于现有的治疗药物具有不良反应较多、作用靶点单一的缺点，致使心力衰竭易反复发作，无法做到根治。因此，深入挖掘其发病机制及探索新的有效治疗方法，仍是目前的重中之重。本研究基于C环(c-ring)的微观结构，通过分析ATP合酶F0复合体C亚基1(ATP5G1)的作用进一步探讨活血化瘀法改善心力衰竭可能的作用机制，为临床治疗心力衰竭提供理论依据及新思路。

1 心肌细胞能量代谢障碍是导致心力衰竭的重要诱因之一

近年来，研究者发现心肌细胞能量代谢障碍理论更适合用于阐述心力衰竭的进展。病理状态下持续的缺血性心肌损害，可诱发产能形式的改变，由优先利用高效的脂肪酸β氧化逐渐转化为低效葡萄糖的无氧酵解，有学者将这一现象定义为“代谢重塑”[6]。该过程可导致游离脂肪酸和乳酸等代谢产物的堆积，并产生脂毒性和葡萄糖毒性，破坏线粒体结构和呼吸链，诱导膜电位下降，线粒体膜通透性转换孔(mitochondrial permeablity transition pore，mPTP)开放，线粒体水肿、崩解，细胞内腺嘌呤核苷三磷酸(ATP)生成减少，心肌细胞死亡[7]。此外，代谢重塑亦可启动心肌细胞凋亡，诱导心肌纤维化，心室重构，进而加速心力衰竭进程[8]。近年来，改善心肌能量代谢的药物日益受到青睐，逐渐成为新型药物研发的主流。2018年《中国心力衰竭诊断和治疗指南》[9]对于该类药物的临床应用给予了充分的肯定，并进行了积极正向的推荐，指出：“心肌细胞能量代谢障碍在心力衰竭的发生和发展中发挥一定作用，使用改善心肌能量代谢的药物，如曲美他嗪、辅酶Q10、辅酶Ⅰ、左卡尼汀、磷酸肌酸等可以改善病人症状和心脏功能，改善生活质量”。因此，心肌细胞能量代谢障碍是导致心力衰竭的重要诱因之一，改善能量代谢可进一步阻止心室重构，防治心力衰竭，具有巨大的潜力。

2 c-ring变构是导致细胞能量代谢障碍的重要病理基础

ATP合酶(ATP synthase)的微观结构：ATP synthase是参与能量代谢的关键酶，在心肌能量生成过程中起着举足轻重的作用[10-11]。ATP synthase又称F1F0 ATP synthase，是由多种亚基组成的复合体，但主要由F1与F0构成，其中F0主要由a、b、c等亚基组成，其中c亚基呈同心圆状排列，亦被称为c-ring。而F1则含有α、β、γ、ε 等亚基，其顶部外形呈橘瓣状，主要是由α和β相互交叉、环形分布而组成的六聚体，而γ和ε亚基则呈棒状，位于六聚体的中央，其上端与α、β亚基相连，下端与c-ring相连[12-15]。ATP synthase合成ATP的工作原理主要是旋转催化机制，即通过特定亚基旋转得到的机械能转换为化学能的过程[16]。能量产生由c-ring的高速旋转驱动，进而把质子跨膜信号传递到F1的顶部，触发β亚基构象发生交替变化来催化ATP 的合成[17-18]。

有研究表明，c-ring变构可诱发mPTP开放，这是心肌细胞能量代谢障碍的重要病理基础：c-ring的中空内部由F1的γ和ε亚基填充，并与之紧密相连[19]。c-ring相当于ATP synthase的转子，而γ和ε亚基则组成ATP synthase的定子。心力衰竭时，在一些病理因子的刺激下，如细胞基质内氧化应激水平升高及钙离子超载可导致c-ring与γ和ε亚基被迫分离，而这一过程触发了mPTP的过度开放[20]。mPTP是存在于线粒体内外膜之间的一种非特异性通道，生理情况下处于关闭状态，病理状态下mPTP开放，可导致线粒体膜电位去极化，线粒体肿胀、破裂，最终引起ATP合成受阻[21-22]。c-ring作为产能“关键装置”，对mPTP的调控具有重要的调节作用。Bonora等[19]用小干扰RNA转染HEK293T细胞(一种易转染的细胞株)，抑制具有稳定c-ring结构作用的因子三磷腺苷合酶抑制因子1(ATPase inhibitory factor 1，ATPIF1)的表达，并将其置于高浓度的钙离子中诱导mPTP开放，结果显示大量消耗的ATPIF1能够促进mPTP的开放，导致线粒体膜电位显著下降。有研究通过观察mPTP的微观结构发现，c-ring可能是mPTP的重要组成部分[23]。以上研究表明c-ring与mPTP之间的关系极为密切，c-ring的结构改变可直接影响mPTP的状态。因此，稳定c-ring结构，抑制mPTP开放，可能是新型药物的研发及治疗心力衰竭潜在的分子靶点。

3 c-ring接受ATP5G1的调控

c-ring的结构：同一物种内，核基因编码的c-ring相对分子量与结构高度保守，c亚基的N端和C端与相邻亚基的对应位置通过α螺旋连接，并形成两个发夹式的同心圆，这些同心圆双向向外扩展，进一步形成圆柱形的疏水孔[24-25]。c-ring直径最小的环和中心轴之间的相互作用提供了ATP synthase转子的膜内和膜外部件之间的关键连接，因此，c-ring必须足够坚固，才能抵御电机在最高300 Hz转速下的高速转动所引起的离心力。当核基因表达异常时，c亚基重新排列，诱导c-ring结构发生改变，促进mPTP开放。

ATP5G1是参与编码c-ring的主要核基因之一[23，26]，其异常表达是导致c-ring结构改变的诱因。研究证实通过替换关键的甘氨酸使ATP5G1发生基因突变，可以促使钙离子介导的mPTP的开放更为敏感，而这一过程与c-ring的重组有关[19]；实验表明，过表达的ATP5G1能够引起c-ring排列疏松，从而导致ATP合成受阻，细胞凋亡[23]。那么是否核基因表达下调对机体能量合成更为有利？答案是否定的。有研究显示，ATP5G1 mRNA表达显著降低可诱发线粒体的破裂，ATP生成同样减少[27]；另有研究报道，通过siRNA的方法使ATP5G1敲除，则可导致细胞磷酸化活性显著降低，最终引起能量合成障碍[28]。以上表明ATP5G1对c-ring构象的调控起着至关重要的作用。因此，ATP5G1更像是调控机体能量代谢的“开关”，目前利用选择性地操纵c-ring这一原理，临床已开发出一系列抗菌药物，然而对心力衰竭的进展中ATP5G1的变化研究甚少。

4 活血化瘀法对核基因ATP5G1的影响

《金匮要略·水气病脉证并治》曰：“心水者，其身重而少气，不得卧，烦而躁，其人阴肿”与《素问·评热病论篇》载：“诸水病者，故不得卧，卧则惊，惊则咳甚也”，以上两段古籍中记录的症状与心力衰竭较为相符。根据典型的临床表现，中医学将心力衰竭归属于“喘证”“水肿”“心悸”的范畴。本病病位主要在心，涉及肝、肺、脾、肾，病机总属本虚标实，血瘀贯穿疾病始终。血瘀由血液运行失常而产生，无论阻滞于脉内或是脉外，均可影响心、肝、脾、肾、肺等脏腑组织的功能。如血瘀留滞于心，导致心脉闭阻，气血运行不畅，可见心悸；“血瘀必兼气滞”，血瘀留滞于肝，可致肝失疏泄，阻碍气机，气机不畅，脾肾通调水道失职，膀胱气化失司，水邪泛滥，发为水肿；血瘀阻滞于肺，可致肺失宣降，肺气胀满，呼吸不利而致喘。因此，血瘀既是病理产物，同时又是导致心力衰竭的重要诱因。若能针对血瘀之病机，活血通络，势必将振奋阳气，给水邪以出路，达到治疗心力衰竭的目的。《仁斋直指方·虚肿方论》创用活血法治疗瘀血水肿，疗效甚佳，沿用至今。张洋等[29]研究了活血化瘀方剂对心力衰竭大鼠心功能的影响，发现采用活血化瘀法可以明显改善心力衰竭。另有研究报道，刘强教授采用活血化瘀法，临证辨证加减治疗瘀水互结之心衰，收效显著[30]。

丹参是活血化瘀的代表性药物，应用广泛，疗效确切，更有“一味丹参，功同四物”之说，是临床治疗血瘀型心力衰竭之要药。《日华子本草》曰：“破宿血，补新生血”；《本草便读》言：“活血之力有余，为调理血分之首药”。丹参素是丹参发挥活血化瘀作用最重要的有效成分。因此，前期本课题组采用丹参素进行药物干预，结果显示：浓度为10 μmol/L丹参素可以明显降低大鼠心肌细胞mPTP的开放程度，促进ATP生成，增强心肌收缩力，进而改善心肌损伤，其作用机制可能与参与下调ATP5G1 mRNA表达有关。为了进一步证实这一理论，采用质粒转染H9C2细胞，使ATP5G1过表达，结果显示丹参素抑制mPTP开放的效应被显著削弱[31]，这为活血化瘀法对ATP5G1的调节作用提供了实验依据。

5 小 结

活血化瘀法发挥心肌保护的作用机制可能与通过参与调节ATP5G1表达，稳定c-ring结构，减少mPTP开放，进而改善心肌细胞能量代谢有关。若能证实这一猜想，则对于治疗心力衰竭具有一定的科学价值。改善心肌能量供给已成为防治心力衰竭的重要目标，科研工作者仍在不遗余力地探索新的有效药物及治疗方法。深入挖掘中医治法对ATP5G1的调控机制具有以下两方面重要意义：一方面为活血类药物治疗血瘀型心力衰竭提供了实验依据；另一方面则有助于阐述心力衰竭的发病机制，并基于c-ring构象研发敏感的治疗药物，这将为临床心力衰竭的治疗提供新思路及干预靶点。