补肾活血方与其组方药材指纹图谱的相关性

王紫燕， 张 梅*， 李春沁， 刘美琳， 董佳悦， 穆敏婕， 谢学军

（1.成都中医药大学药学院，中药材标准化教育部重点实验室，中药资源系统研究与开发利用省部共建国家重点实验室培育基地，四川成都611137；2.成都中医药大学临床医学院，四川成都610075）



补肾活血方与其组方药材指纹图谱的相关性

王紫燕1， 张 梅1*， 李春沁1， 刘美琳1， 董佳悦1， 穆敏婕1， 谢学军2*

（1.成都中医药大学药学院，中药材标准化教育部重点实验室，中药资源系统研究与开发利用省部共建国家重点实验室培育基地，四川成都611137；2.成都中医药大学临床医学院，四川成都610075）

摘要:目的 建立补肾活血方（地黄、丹参、葛根、人参）的HPLC-DAD-ELSD指纹图谱，研究该方与其组方药材指纹图谱的相关性。方法 通过HPLC-DAD-ELSD法建立复方及各单味药材指纹图谱，以色谱峰保留时间和紫外光谱信息为考察指标。结果 补肾活血方HPLC-DAD-ELSD指纹图谱中标定了35个共有峰，其中有10个色谱峰来自丹参，9个来自葛根，9个来自人参，地黄对共有峰的贡献不明显。另外，1个色谱峰为丹参和葛根共有，6个色谱峰不能明确其来源。结论 HPLC-DAD建立的指纹图谱反映丹参和葛根中化学成分的相似度较高（均大于0.8），而HPLCELSD建立的指纹图谱反映人参中化学成分的相似度相对偏低。

关键词:补肾活血方；组方药材；指纹图谱；HPLC-DAD-ELSD

dol:10.3969/j.issn.1001-1528.2016.02.024

KEY W 0RDS: Bushen Huoxue PrescriPtion；re1evant herbs；fingerPrints；HPLC-DAD-ELSD

糖尿病是世界各国日益关注的公共健康问题，其中糖尿病视网膜病变（diabetic retinoPathy，DR）是导致糖尿病患者失明的最主要、最严重、最棘手的并发症，也是世界四大致盲眼病之一。中医药在改善糖尿病患者的视力损害，延缓DR的发生发展，促使发生病理变化的眼底恢复以及改善提高患者全身整体状况和生活质量方面有其独特的优势，显示出广阔的前景。补肾活血方由成都中医药大学附属医院眼科谢学军教授等研制而成，由地黄、丹参、葛根、人参等中药配伍组成，用于防治糖尿病性视网膜病变，效果良好［1］。谢学军课题组对其防治DR的作用机制进行了深入研究，已取得多项研究结果［2-7］，但对该方药效物质基础及质量控制的研究还鲜有报道。

中药指纹图谱已成为国际公认的控制中药或天然药物质量的一种有效手段，它能够较全面地反映出中药质量的综合信息［8］。中药复方由组方中药配伍而成，文献［9-13］报道，在分别建立复方与单味药材指纹图谱的基础上，通过研究其色谱峰之间的相关性，归属复方色谱峰的来源，分析复方与单味药材化学成分的关联性，可为复方药效物质基础研究及质量控制奠定基础。本实验采用HPLCDAD-ELSD法建立补肾活血方指纹图谱，并对复方化学成分指纹图谱色谱峰的归属进行了研究。

1 仪器与试药

1.1 仪器 Agi1ent 1200高效液相色谱仪，包括Agi1ent 1200四元泵、Agi1ent 1200色谱工作站、DAD检测器（美国Agi1ent公司）；A11tech 3300型蒸发光散射检测器（美国A11tech公司）；中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2004A版，国家药典委员会）；KQ-3200E型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；TGL-16G型高速台式离心机（上海右一仪器有限公司）。

1.2 试药 乙腈为色谱纯（美国Tedia公司）；其他试剂均为分析纯（成都市科龙化工试剂厂）；纯净水（Mi11i-Q纯水制备系统制备，0.45 μm滤膜滤过）。

地黄、丹参、葛根、人参购自成都市荷花池药材市场，经成都中医药大学中药资源与鉴定系裴瑾教授鉴定，分别为玄参科植物地黄Rehmannia glutinosa Libosch.的干燥块根、唇形科植物丹参Salvia miltiorrhiza Bge.的干燥根、豆科植物甘葛藤粉葛Pueraria thomsoni i Benth.的干燥根、五加科植物人参Panax ginseng C.A.Mey.的干燥细支根或须根。

丹酚酸B（sa1viano1ic acid B）、葛根素（Puerarin）、人参皂苷Rg1（ginsenoside Rg1）、人参皂苷Rb1（ginsenoside Rb1）对照品均购自成都曼思特生物科技有限公司，纯度均≥98％。

2方法与结果

2.1 供试品溶液的制备 按照课题组提供的方法制备样品［1］。取复方粉末0.2 g，加甲醇5 mL超声溶解，离心（3 000 r/min）10 min，取上清液，过0.45 μm微孔滤膜备用。单味药、复方阴性的处理方法同复方，取上清液，过0.45 μm微孔滤膜备用。

2.2 对照品溶液的制备 分别精密称取上述对照品适量，甲醇超声溶解，合并至同一量瓶中，甲醇定容，即得。

2.3 色谱条件 Inertsi1 ODS-SP C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相为乙腈（A）-0.05％甲酸水（B）；体积流量1 mL/min；柱温30℃；进样量20 μL；检测波长250 nm；漂移管温度50℃；载气流量2.5 L/min；增益值1；线性梯度洗脱（0～10 min，1％～10％A；10～15 min，10％～16％A；15～27 min，16％～23％A；27～50 min，23％～39％A；50～60 min，39％～50％ A；60～65 min，50％～70％ A；65～70 min，70％～100％A）。

2.4 方法学考察

2.4.1 精密度试验 精密吸取同一供试品溶液（S1），在“2.3”项色谱条件下连续进样6次，进行HPLC分析。结果，在各共有峰的相对保留时间RSD中，DAD检测器小于1％，ELSD检测器小于3％；在各共有峰的相对峰面积RSD中，DAD检测器小于1％，ELSD检测器小于3％，说明仪器精密度良好。

2.4.2 稳定性试验 精密吸取同一供试品溶液（S1），在“2.3”项色谱条件下，于0、3、6、12、18、24 h进行HPLC分析。结果，在各共有峰的相对保留时间RSD中，DAD检测器小于2％，ELSD检测器小于5％；在各共有峰的相对峰面积RSD中，DAD检测器小于1％，ELSD检测器小于3％，说明溶液在24 h内稳定。

2.4.3 重复性试验 取同一样品（S1）6份，按“2.1”项下方法制备样品，在“2.3”项色谱条件下进行HPLC分析。结果，在各共有峰的相对保留时间RSD中，DAD检测器小于2％，ELSD检测器小于5％；在各共有峰的相对峰面积RSD中，DAD检测器小于3％，ELSD检测器小于5％，说明该方法重复性良好。

2.5 HPLC-DAD-ELSD指纹图谱的建立及特征峰的标定 取10批样品（来源见表1），按“2.1”和“2.3”项下方法操作，根据供试品溶液HPLC谱的相关系数来比较供试品谱图。结果，DAD检测器中有23个峰是各批供试品所共有的，ELSD检测器中有12个峰是各供试品所共有的，因此确定这35个峰为共有指纹峰，色谱图见图1～2。其中，8号峰为葛根素（参照峰），20号峰为丹酚酸B，5'号峰为人参皂苷Rg1，9'号峰为人参皂苷Rb1（参照峰）。

表1　1 0批样品的来源Tab.1 Sources of ten batches of samples

图1　补肾活血方HP LC-DAD对照指纹图谱Flg.1 HPLC-DAD reference flngerprlnt of Bushen Huoxue prescrlptlon

图2　补肾活血方HPLC-ELSD对照指纹图谱Flg.2 HPLC-ELSD reference flngerprlnt of Bushen Huoxue prescrlptlon

2.6 指纹图谱相似度分析 应用国家药典委员会“中药指纹图谱相似度评价系统（2004A版）”软件，以10批样品的指纹生成对照指纹图谱R，并评价其相似度。指纹图谱见图3～4。相似度结果见表2～3。

图3　补肾活血方HPLC-DAD指纹图谱Flg.3 HPLC-DAD flngerp rlnts of Bushen Huoxue prescrlptlon

图4　补肾活血方HPLC-ELSD指纹图谱Flg.4 HPLC-ELSD flngerprlnts of Bushen Huoxue prescrlptlon

表2　DAD检测器中1 0批样品相似度Tab.2 Slm llarltles of ten batches of sam p les ln DAD detector

表3　E LSD检测器中1 0批样品相似度Tab.3 Slm llarltles of ten batches of samples ln ELSD detector

2.7 复方与药材指纹图谱相关性分析 采用HPLC-DAD-ELSD法，在“2.3”项色谱条件下操作，得到复方、药材、复方阴性供试品的指纹图谱，以色谱峰保留时间和紫外光谱特征为指标，考察相关性，对复方化学指纹图谱的峰归属进行分析。结果，有10个色谱峰来自丹参（图5），9个来自葛根（图6），9个来自人参（图7），地黄对复方共有峰的贡献不明显。另外，1个色谱峰为丹参和葛根共有，6个色谱峰不能明确其来源。

图5　复方与丹参药材HPLC-DAD图谱Flg.5 HPLC-DAD chromatogram s of p rescrlptlon and Salvia m iltiorrhiza Bge.

图6　复方与葛根药材HPLC-DAD图谱Flg.6 HPLC-DAD chromatogram s of prescrlptlon and Pueraria thomsoni l Benth.

图7　复方与人参药材HPLC-ELSD图谱Flg.7 HPLC-ELSD chromatograms of prescrlptlon and Panax ginseng C.A.M ey.

3 讨论

3.1 指纹图谱相似度评价 实验中10批补肾活血方由不同来源的单味药材随机组合而成。HPLCDAD建立的指纹图谱主要反映复方中丹参和葛根药材所含的化学成分，其相似度较高（均大于0.8），说明不同产地两者化学成分的差异较小；HPLC-ELSD建立的指纹图谱主要反映复方中人参的化学成分，其相似度相对偏低，说明不同产地和贮存时间下，人参的成分有一定差异。

3.2 检测方式的选择 将DAD与ELSD检测器联用，同时检测到有紫外吸收、紫外末端吸收以及无紫外吸收的成分，得到一次进样后同时测定不同成分的指纹图谱，省时方便。

3.3 洗脱条件的考察 补肾活血方成分复杂，本实验考察了乙腈-0.05％甲酸水、乙腈-0.1％甲酸水、乙腈-0.5％冰乙酸水、甲醇-0.05％甲酸水等流动相的等度及梯度洗脱条件。结果发现，以乙腈-0.05％甲酸水梯度洗脱时，各色谱峰基本分离。3.4 检测波长的考察 对DAD检测器所得的指纹图谱进行了190～400 nm的全波长扫描，重点考察了250、254、270、286 nm几个波长下的峰数目和峰形。结果表明，在250 nm波长下，指纹图谱色谱峰的数目最多，峰形较优。

3.5 ELSD检测器参数的考察 分别对漂移管温度（45、50℃）及载气流量（1.5、2.0、2.5 L/min）等参数进行了考察。结果表明，漂移管温度为50℃，载气流量为2.5 L/min时，色谱图基线信噪比最优，色谱峰分离良好。

3.6 复方与组方药材相关性分析 比较复方与组方药材的色谱图发现，组方药材对共有峰的贡献为丹参（5、10、15～21、23）、葛根（6～9、11～14、22）、人参（3'～5'、7'～12'），而且1号峰为丹参和葛根共有。丹参和葛根的大部分色谱峰都能与复方对应，有良好的相关性，但人参60 min后的色谱峰在复方中没有体现，可能是由于复方在煎煮过程中，成分之间相互发生作用，某些成分转化或损失而导致。2～4、1'、2'、6'号峰来源不清，是否是组方药材共煎时产生的新成分暂不能确定。综上所述，复方与组方药材的成分存在差异，两者之间并非简单的加和关系。

同时，采用DAD检测器在203 nm波长下，对复方与地黄的相关性进行研究，但地黄对复方共有峰的贡献不明显。究其原因，复方中环烯醚萜类、酚酸类及异黄酮类成分的极性均较大，酚酸类及异黄酮类成分的峰面积远大于环烯醚萜类，而且末端检测基线不平稳，环烯醚萜类成分受到较强干扰。因此，在兼顾复方各类成分分析时，没能体现该类成分对复方的贡献，有待于作进一步探索。

本实验对复方成分的来源归属作了初步研究，为阐明补肾活血方的药效物质基础提供了实验依据。对于复方各成分的结构确定，还需结合HPLCDAD-MS、UPLC-Q-TOF/MS及UPLC-Q-TOF-MS/ MS等手段进行深入研究。

参考文献:

［1］ 谢学军，张 梅，王明芳.一种中药组合物及其制备方法:中国，200910308470.3［P］.2010-03-03.

［2］ 万 李，谢学军，马 荣.补肾活血中药血清对缺氧条件下纯化培养视网膜神经节细胞的保护作用及其机制［J］.中华实验眼科杂志，2014，32（3）: 211-215.

［3］ 马殿伟，谢学军，张 梅，等.补肾活血剂对高糖和（或）缺氧状态下视网膜神经节细胞活力及谷氨酰胺合成酶活性的影响［J］.眼科新进展，2014，34（6）: 510-513.

［4］ 姚红娥，张 梅，徐 秒，等.人参皂苷对糖基化终末产物条件下视网膜Mü11er细胞活力的影响［J］.中国实验方剂学杂志，2014，20（9）: 157-161.

［5］ 马殿伟，谢学军，张 梅，等.补肾活血剂对TGF-β2干预缺氧状态下视网膜Mü11er细胞谷氨酸代谢的影响［J］.眼科新进展，2013，33（9）: 804-807.

［6］ 宋明霞，谢学军，万 李，等.高糖及糖基化终末产物对视网膜Mü11er细胞缺氧诱导因子-1α介导缺氧信号通路的影响［J］.眼科新进展，2013，33（12）: 1106-1110.

［7］ 徐 秒，张 梅，姚红娥，等.丹参脂溶性成分对大鼠视网膜Mü11er细胞的毒性作用研究［J］.华西药学杂志，2013，28（5）: 453-455.

［8］ 詹丹丹.浅谈中药指纹图谱研究［J］.黑龙江医药，2013，26（3）: 439-441.

［9］ 冯素香，王淑美，梁生旺，等.复方脑脉通有效部位与药材指纹图谱相关性研究［J］.中成药，2010，32（5）: 701-704.

［10］ 黄春跃，杨义芳，唐博雅，等.白头翁汤颗粒剂指纹图谱与组方药材及其提取物的相关性［J］.中国医药工业杂志，2013，44（2）: 175-179.

［11］ 于 艳，徐 晶，修丽丽，等.三黄滴丸的HPLC-DAD指纹图谱及其与组方药材的相关性研究［J］.中国药学杂志，2013，13（48）: 1057-1060.

［12］ 黄春跃，杨义芳，唐博雅，等.栀子厚朴汤颗粒指纹图谱与组方药材及其提取物的相关性研究［J］.中成药，2013，35（8）: 1720-1723.

［13］ 杨小秋，罗文汇，董玉娟，等.厚朴四君子汤颗粒的HPLC指纹图谱及其与组方药材的相关性研究［J］.亚太传统医药，2014，10（13）: 14-19.

Relatlonshlp between the flngerprlnts of Bushen Huoxue prescrlptlon and lts relevant herbs

WANG Zi-yan1， ZHANG Mei1*， LIChun-qin1， LIU Mei-1in1， DONG Jia-yue1， MU Min-jie1，XIE Xue-jun2*
（1.School of Pharmacy，Chengdu University of Traditional ChineseMedicine；Key Laboratory of Standardization of Chinese Herbal Medicinesof Ministry of Education；State Key Laboratory Breeding Base of Systematic Research，DeveloPment and Utilization of Chinese Medicine Resources，Chengdu 611137，China；2.School of Clinical Medicine，Chengdu University of Traditional ChineseMedicine，Chengdu 610075，China）

ABSTRACT:AIM To estab1ish an HPLC-DAD-ELSD fingerPrint of Bushen Huoxue PrescriPtion（Rehmannia glutinosa Libosch.，Salvia miltiorrhiza Bge.，Pueraria thomsoni i Benth.and Panax ginseng C.A.Mey.）and study the re1ationshiP between the fingerPrints of this PrescriPtion and its re1evantherbs.METH0DS The finger-Prints of Bushen Huoxue PrescriPtion and its re1evant herbs were estab1ished by HPLC-DAD-ELSD.The retention time and UV sPectra1information of chromatograPhic Peakswere taken as indices.RESULTS Thirty-five common Peakswere demarcated in the HPLC-DAD-ELSD fingerPrint of Bushen Huoxue PrescriPtion.Among them，tenbook=342,ebook=120Peaks came from S.miltiorrhiza，nine Peaks came from P.thomsonii，nine Peaks came from P.ginseng，and R. glutinosa did notmake a great contribution to the common Peaks.In addition，one Peak came from S.miltiorrhiza and P.Ginseng，whi1e another six Peaks cou1d not be identified.C0NCLUSI0N HPLC-DAD fingerPrint ref1ects the high simi1arities（＞0.8）of chemica1 constituents in S.Miltiorrhiza and P.Thomsonii，whi1e HPLCELSD fingerPrint revea1s the 1ow simi1arities of those in P.Ginseng.

*通信作者:张 梅（1963—），女，教授，博士生导师，从事中药及其复方物质基础的质量标准化研究。Te1:（028）61800231，E-mai1: zhangmei63@126.com谢学军（1963—），女，教授，博士生导师，从事中西医结合防治眼底病的基础与临床研究。Te1:（028）87767332，E-mai1: xxj8848@163.com

作者简介:王紫燕（1991—），女（回族），硕士，研究方向为药物分析。Te1: 18384257028，E-mai1: 462207970@qq.com

基金项目:国家自然科学基金项目（81473735）

收稿日期:2015-05-12

中图分类号:R284.1

文献标志码:A

文章编号:1001-1528（2016）02-0341-05