HPLC法同时测定当归四逆汤中3种有效成分

陈 瑛， 付正丰， 方应权， 岳秀永

（重庆三峡医药高等专科学校药学系，重庆404120）



HPLC法同时测定当归四逆汤中3种有效成分

陈 瑛， 付正丰*， 方应权， 岳秀永

（重庆三峡医药高等专科学校药学系，重庆404120）

摘要:目的 建立同时测定当归四逆汤（当归、桂枝、芍药、通草等）中甘草苷、细辛脂素和桂皮醛含有量的高效液相色谱（HPLC）法。方法 分析采用Symmetry®Shie1d C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5.0 μm）；0.05％磷酸溶液-乙腈为流动相，梯度洗脱；体积流量1.0 mL/min；检测波长分别为甘草苷237 nm、细辛脂素和桂皮醛287 nm；柱温35℃。结果 甘草苷、细辛脂素和桂皮醛分别在4.042～40.42 μg/mL、0.196 0～19.60 μg/mL和10.08～100.8 μg/mL范围内线性关系良好（r≥0.999 8），平均回收率在96.7％～97.0％之间。结论 该方法专属性强，准确可靠，可用于完善当归四逆汤的质量标准。

关键词:当归四逆汤；甘草苷；细辛脂素；桂皮醛；高效液相色谱（HPLC）

KEY W 0RDS: Danggui Sini Decoction；1iquiritin；asarinin；cinnama1dehyde；high Performance 1iquid chromatograPhy（HPLC）

当归四逆汤出自《伤寒论》，由当归12 g，桂枝9 g，芍药9 g，通草6 g，细辛3 g，炙甘草6 g，大枣8枚组成［1］，具有温经散寒、养血通脉的作用，被公认为治疗血虚寒厥证的代表方［2-3］。现代药理研究显示，其具有扩血管、抗凝、抗血栓等作用。目前，关于当归四逆汤中有效成分的测定主要集中于阿魏酸、肉桂酸、芍药苷、甘草酸等［4-5］，本实验采用高效液相色谱（HPLC）法，同时测定当归四逆汤中甘草苷、细辛脂素和桂皮醛的含有量，可为完善其质量标准提供参考。

1 仪器与试药

岛津LC-20AT高效液相色谱仪，配有二元泵、自动进样器、可变波长紫外检测器、岛津LC-So1ution色谱工作站（日本岛津公司）；FW177中药粉碎机（天津市泰斯特仪器有限公司）；Mi11iPore-Q超纯水仪（美国Mi11iPore公司）；KQ-400KDB超声波清洗器（昆山超声仪器有限公司）；赛多利斯R200D电子天平（德国赛多利斯公司）。

当归四逆汤各味药材均购自重庆市綦江县药材公司，经三峡中药研究所付绍智教授鉴定，符合中国药典（2010版）的规定。对照品均购自中国食品药品检定研究院，分别为甘草苷（批号140857-200411）、细辛脂素（批号141023-200516）、桂皮醛（批号141221-200405）。乙腈为色谱纯；其他试剂均为分析纯；水为超纯水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 Symmetry®Shie1d C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），采用波长切换方式，即237 nm（0～15 min）、287 nm（15～45 min）；柱温35℃；流动相0.05％磷酸溶液（A）-乙腈（B），梯度洗脱（0～15 min，20％B；15～45 min，20～48％ B）；体积流量1.0 mL/min；进样量20 μL。理论塔板数按甘草苷、细辛脂素和桂皮醛计，均不低于4 000。

2.2 溶液的配制

2.2.1 对照品溶液 分别精密称取甘草苷、细辛脂素和桂皮醛对照品适量，加甲醇配制成对照品贮备液，分别含甘草苷2.021 mg/mL、细辛脂素0.392 mg/mL和桂皮醛2.016 mg/mL。精密吸取上述对照品溶液适量，置于同一量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得混合对照品贮备溶液，含甘草苷404.2 μg/mL、细辛脂素19.60 μg/mL和桂皮醛1 008 μg/mL。然后，精密吸取混合对照品贮备液适量，加甲醇稀释20倍，即得。

2.2.2 供试品溶液 除大枣外，按处方比例称取当归等6味药材，粉碎，过3号筛，按处方1/8的的量精密称取粉末，加粉碎过的大枣1枚，最终平均质量约为11.6 g。置于具塞锥形瓶中，精密加入甲醇200 mL，密塞，称定质量，超声处理（250 W、40 kHz）30 min，放冷，再称定质量，甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.2.3 阴性供试品溶液 按“2.2.2”项下方法，分别制备缺炙甘草、细辛、桂枝的阴性供试品溶液。

2.3 方法专属性 精密吸取上述混合对照品、供试品以及阴性供试品溶液适量，在“2.1”项条件下进行分析，记录色谱图，结果见图1。由图可知，甘草苷、细辛脂素和桂皮醛在各自对应的位置无干扰，表明该方法专属性良好。

1.甘草苷 2.细辛脂素 3.桂皮醛1.1iquiritin 2.asarinin 3.cinnama1dehyde图1　高效液相色谱图Flg.1 HPLC chrom atogram s

2.4 线性关系考察 分别精密吸取混合对照品贮备液0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL，置于10 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，进样分析。以峰面积Y对进样浓度X（μg/mL）进行线性回归，得甘草苷、细辛脂素和桂皮醛的回归方程、相关系数（r）和线性范围，结果见表1。

表1　3种成分的线性关系Tab.1 L lnear relatlonshlps of three constltuents

2.5 精密度试验 分别取“2.2.1”项下混合对照品溶液，连续进样6次，按上述色谱条件测定甘草苷、细辛脂素、桂皮醛的峰面积。结果显示，其RSD值分别为1.7％、1.3％和0.95％，表明仪器精密度良好。

2.6 稳定性试验 根据处方比例精密称取各药材，制备供试品溶液，室温下放置，按上述色谱条件分别于0、2、4、6、8、10 h进样，测定甘草苷、细辛脂素和桂皮醛峰的峰面积。结果显示，其RSD值分别为1.7％、1.8％和1.2％，表明溶液在室温下10 h内稳定性良好。

2.7 重复性试验 根据处方比例精密称取各药材，共6份，制备供试品溶液，按上述色谱条件测定甘草苷、细辛脂素和桂皮醛的峰面积。结果显示，其RSD分别为1.3％、1.6％、1.1％，表明该方法重复性良好。

2.8 加样回收试验 精密称取含有量已知（甘草苷0.322 mg/g、细辛脂素0.016 2 mg/g、桂皮醛1.01 mg/g）的供试品6份，每份5.8 g，加混合对照品溶液5 mL，按“2.3”项下方法制备，代入标准曲线计算各组分的含有量，结果见表2。

2.9 样品测定 取3批供试品，按上述方法制备供试品溶液，测定并计算含有量，结果见表3。

表2　加样回收试验结果Tab.2 Results of recovery tests

表3　样品测定结果（n=3）Tab.3 Determ lnatlon results of sam ples（n=3）

3 讨论

3.1 供试品提取方法 根据文献［6-8］，本实验考察了提取溶剂的种类和提取方法，分别比较了甲醇、100％乙醇和70％乙醇，发现以甲醇为溶剂的提取效果最好。同时，比较了回流和超声提取方法，发现两者无显著性差异，但后者简便、节能，因此选择超声提取。另外，还比较了不同超声功率和提取时间，最终确定功率250 W，频率40 kHz，超声处理30 min。

3.2 色谱条件的优化 为保证被测组分有良好的分离度和适当的保留时间，参照文献［4，9-10］方法，考察了不同的流动相的组成、比例及洗脱方案，发现乙腈的分离效果好于甲醇，而且甘草苷等3种被测物质在偏酸性条件下的分离理论板数较好，最终确定以0.05％磷酸-乙腈为流动相。由于中药复方所含成分较多，故本实验采用梯度洗脱，可使被测物质和杂质得到良好的分离。另外，根据3种化合物紫外吸收波长的差别，甘草苷在237 nm波长处均有明显吸收［11］，而细辛脂素和桂皮醛在287 nm附近有较强的紫外吸收［12-13］，并且杂质干扰少。因此，参考文献［14-15］报道的方法，结合检测组分的保留时间，采用波长切换法相应地设置检测波长。

参考文献:

［1］ 高宇勤，赵国平，汪仁望.当归四逆汤中阿魏酸在大鼠血清中含量测定及药动学研究［J］.中成药，2011，33（3）: 419-422.

［2］ 刘 赟.基于“方-基本-体质”模式的当归四逆汤方证研究［D］.广州:广州中医药大学，2014.

［3］ 熊 辉.当归四逆汤的现代药理与临床应用分析［J］.中国医药指南，2014，5（12）: 301-302.

［4］ 高宇勤，赵 国，江仁望.当归四逆汤中阿魏酸在大鼠血清中含量测定及药动学研究［J］.中成药，2011，33（3）: 419-422.

［5］ 赵 欣，谷 艳，宋欣鑫，等.HPLC法同时测定当归四逆汤中4种有效成分的含量［J］.沈阳药科大学学报，2008，25（3）: 200-203.

［6］ 陈良慧，单进军，谢 彤，等.LC-MS/MS法测定复方祖师麻提取物中8种成分溶出影响［J］.中成药，2014，36 （5）: 965-969.

［7］ 宋双红，色林格，陈 蓓，等.HPLC法测定4种细辛中马兜铃酸Ⅰ和细辛脂素［J］.中成药，2014，36（8）: 1711-1715.

［8］ 于 艳，张立德，田 原，等.HPLC波长切换法同时测定桂枝茯苓丸中4种成分［J］.中成药，2013，35（11）: 2426-2429.

［9］ 钱永健，张 超.HPLC法测定出血热预防片中的女贞苷、特女贞苷、哈巴苷和哈巴俄苷［J］.中成药，2015，37（1）: 116-120.

［10］ 刘书芬，梁倩倩，陈 岩，等.HPLC法同时测定防己黄芪汤中5种成分［J］.中成药，2014，36（11）: 2312-2315.

［11］ 易 伟，狄留庆，李俊松，等.HPLC同时测定复方祖师麻片中8种有效成分的含量［J］.南京中医药大学学报，2015，31（1）: 74-76.

［12］ 高 森，李正翔，王志涛，等.九龙化风丸中升麻素苷、5-O-甲基维斯阿米醇苷、羌活醇、异欧前胡素和细辛脂素的HPLC梯度洗脱法测定［J］.中成药，2014，36（3）: 541-547.

［13］ 张丽珍，周之荣.高效液相色谱法测定四味清口含片中桂皮醛和橙皮苷的含量［J］.医药导报，2014，33（12）: 1627-1630.

［14］ 张 梅，任爱农，杨玉兰，等.HPLC波长切换法同时测定清清颗粒中9个成分的含量［J］.药物分析杂志，2015，35（1）: 29-33.

［15］ 季宁平，徐晓秋，傅超美，等.HPLC法同时测定艾附暖宫丸中芍药苷、阿魏酸和川续断皂苷Ⅵ［J］.中成药，2015，37（3）: 534-537.

dol:10.3969/j.issn.1001-1528.2016.02.020

Slmultaneous determ lnatlon of three effectlve com ponents ln Danggul Slnl Decoctlon

CHEN Ying， FU Zheng-feng*， FANG Ying-quan， YUE Xiu-yong
（DePartment of Pharmacy，Chongqing Three-Gorge Medical College，Chongqing 404120，China）

ABSTRACT:AIM To deve1oP an HPLC method for the simu1taneous determination of 1iquiritin，asarinin and cinnama1dehyde in Danggui Sini Decoction（Angelicae sinensis Radix，Cinnamomi Cassiae Ramulus，Paeoniae Lactilorae Radix and TetraPanacis PaPyriferi Medulla，etc.）. M ETH 0 DS Symmetry®Shie1d C18co1umn （250 mm×4.6 mm，5.0 μm）maintained at 35℃was used with 0.05％PhosPhoric acid-acetonitri1e asmobi1e Phase at a f1ow rate of1.0 mL/min in a gradiente1ution manner.The detection wave1engthswere setat223 nm for 1iquiritin，and 287 nm for asarinin and cinnama1dehyde.RESULTS Liquiritin，asarinin and cinnama1dehyde dis-P1ayed good 1inear re1ationshiPswithin the ranges of4.042 -40.42 μg/mL，0.196 0 -19.60 μg/mL and 10.08 -100.8 μg/mL（r≥0.999 8），resPective1y，with the average recoveries of 96.7％ -97.0％.C0NCLUSI0 N With good sPecificity，accuracy and re1iabi1ity，thismethod can he1P to imProve the qua1ity standard for Danggui Sini Decoction.

中图分类号:book=326,ebook=104 R927.2

文献标志码:A

文章编号:1001-1528（2016）02-0325-04

*通信作者:付正丰（1978—），男，硕士，讲师，主要从事中草药资源开发与应用研究。Te1: 13996539870，E-mai1: 862120258@ qq.com

作者简介:陈 瑛（1964—），女，副教授，主要从事有机化学的研究。Te1: 13594468289

基金项目:重庆市卫生计划委中医药科技项目（2011-2-15）

收稿日期:2015-05-13

网络出版日期: 2015-06-15

网络出版地址: httP://www.cnki.net/kcms/detai1/31.1368.R.20150615.1344.001.htm1