不同途径移植人脐带间充质干细胞在糖尿病大鼠胰腺组织中的定植效果比较

王宪华，连杰，翁孝刚，王涛，王晓琳，胡俊鹏

(1新乡医学院第一附属医院，河南卫辉453100；2河南省华隆生物技术有限公司；3新乡医学院第三附属医院)



不同途径移植人脐带间充质干细胞在糖尿病大鼠胰腺组织中的定植效果比较

王宪华1，连杰2，翁孝刚3，王涛1，王晓琳1，胡俊鹏1

(1新乡医学院第一附属医院，河南卫辉453100；2河南省华隆生物技术有限公司；3新乡医学院第三附属医院)

目的比较经尾静脉、肝实质内及胰腺被膜下输注的人脐带间充质干细胞(hUCMSCs)在糖尿病大鼠胰腺组织中的移植定植效果，探讨hUCMSCs移植治疗糖尿病的最佳途径。方法 取采用一次性腹腔注射链脲佐菌素制备1型糖尿病(T1DM)大鼠42只，随机分为模型尾静脉组、模型肝实质组、模型胰腺被膜组各6只，观察尾静脉组、观察肝实质组、观察胰腺被膜组各8只。观察尾静脉组、观察肝实质组、观察胰腺被膜组分别经尾静脉、肝实质内、胰腺被膜下途径注射hUCMSCs悬液0.4 mL，模型尾静脉组、模型肝实质组、模型胰腺被膜组分别经尾静脉、肝实质内、胰腺被膜下途径注射生理盐水0.4 mL。各组均干预4周。取各组胰腺组织，采用HE染色法观察组织病理学。采用RT-PCR法检测胰腺组织胰岛素mRNA表达，采用免疫组化法检测胰腺组织胰岛素蛋白表达。应用MAB1281蛋白示踪剂，采用免疫组化法检测胰腺组织MAB1281蛋白表达，评价hUCMSCs定植示踪情况。结果 模型各组胰岛结构有不同程度破坏，胰岛细胞数量减少，部分发生空泡变性，胰岛边缘炎性细胞浸润明显；观察各组胰岛结构相对完整，炎症反应较轻。观察各组胰腺组织胰岛素mRNA及蛋白表达量均高于模型各组(P<0.05)，观察胰腺被膜组胰腺组织胰岛素mRNA及蛋白表达量高于观察尾静脉组及观察肝实质组(P均<0.05)。模型各组及观察肝实质组均未见MAB1281蛋白阳性表达，观察尾静脉组及观察胰腺被膜组均可见MAB1281蛋白阳性表达区域，且观察胰腺被膜组表达高于观察尾静脉组(P<0.05)。结论 三种途径移植hUCMSCs均可起不同程度的治疗作用，胰腺被膜下注射效果最佳。

1型糖尿病；人脐带间充质干细胞；静脉注射；用药途径;肝脏；胰腺；移植

1型糖尿病(T1DM)是由多因素引起胰岛β细胞渐进性破坏、最终导致胰岛素绝对缺乏的慢性自身免疫性疾病[1]，至今仍无法治愈[2]。最根本的治疗方法是胰腺或胰岛移植以恢复糖稳态[3,4]。细胞疗法被视为一种可治愈T1DM的治疗方法，但因缺乏合适的供体来源而受到限制[5]。近年研究发现，骨髓、脐带来源的间充质干细胞(MSCs)可逆转T1DM[6,7]。人脐带间充质干细胞(hUCMSCs)比骨髓源性MSC(BMSC)更易扩增、分化，其形态、免疫表型及多分化潜能等生物学特性与BMSC极为相似，是同种异源中较好的MSC来源[8,9]。目前国内外对hUCMSCs单一移植途径进行研究较多，而很少对全身或局部多种不同途径治疗DM模型鼠的效果进行对照研究，不同移植途径对于hUCMSCs在胰腺组织定植的效果尚不明确。2014年12月～2015年10月，我们对糖尿病大鼠分别经尾静脉、肝实质内及胰腺被膜下三种途径输注hUCMSCs，观察其在胰腺组织中的移植定植效果，为研究hUCMSCs治疗糖尿病的最佳途径提供实验基础。

1　材料与方法

1.1材料清洁级6周龄雄性SD大鼠80只，体质量150～170 g，由河南省实验动物中心提供。链脲佐菌素(STZ，美国 Sigma 公司)；MSC检测试剂盒(美国 BD公司)；小鼠抗Insulin抗体、大鼠胰岛素ELISA试剂盒(武汉博士德生物工程有限公司)；小鼠抗人细胞核抗体MAB1281(Millipore公司)；GTVisionTMⅢ抗鼠/兔通用型免疫组化检测试剂盒(上海基因科技有限公司)；RNAiso Plus、PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser、Ex Taq®(Takara公司)。引物合成由上海生工生物工程股份有限公司完成。

1.2 hUCMSCs的来源和鉴定hUCMSCs由河南省华隆生物技术有限公司提供。细胞经需氧菌、厌氧菌及支原体等微生物检测，微生物检测结果均为阴性；经流式细胞仪检测间充质干细胞表型包括CD11b、CD19、CD34、CD45、HLA-DR、CD73、CD90和CD105，细胞表型符合间充质干细胞表型特征，符合国际细胞治疗协会(ISCT)关于hUCMSCs表型的界定[10]。

1.3动物分组及模型制备大鼠经适应性喂养1周后，随机选择其中62只，采用一次性腹腔注射STZ 60 mg/kg方法制备T1DM模型。以注射后第3、7、10天静脉血糖水平均>16.7 mmol/L为造模成功[11]。剔除造模过程中死亡及血糖不达标的大鼠，取造模成功大鼠42只，随机分为模型尾静脉组、模型肝实质组、模型胰腺被膜组各6只，观察尾静脉组、观察肝实质组、观察胰腺被膜组各8只。

1.4hUCMSCs移植取第3代hUCMSCs，用生理盐水调整细胞浓度。观察尾静脉组、观察肝实质组、观察胰腺被膜组分别经尾静脉、肝实质内、胰腺被膜下途径注射hUCMSCs悬液0.4 mL(含1×106个细胞)，模型尾静脉组、模型肝实质组、模型胰腺被膜组别经尾静脉、肝实质内、胰腺被膜下途径注射生理盐水0.4 mL。共干预4周。

1.5胰腺组织hUCMSCs定植效果观察

1.5.1胰腺组织病理学观察麻醉大鼠后开腹、开胸，进行心脏灌注固定后，剪取胰腺组织放至10%中性甲醛固定液中。制备胰腺组织石蜡切片，行HE染色，观察胰腺组织病理变化。

1.5.2胰腺组织胰岛素mRNA表达检测采用RT-PCR法。提取胰腺组织RNA，设计人及大鼠胰岛素RNA引物，片段长度均为200 bp，使用RNAiso试剂提取胰腺组织总RNA，逆转录为cDNA，使用Ex Taq®进行PCR反应。扩增产物经琼脂糖凝胶电泳成像系统扫描，采用Image J软件分析条带灰度值，结果用靶基因与内参条带灰度值比值表示。

1.5.3胰腺组织胰岛素蛋白表达检测采用免疫组化法。取胰腺组织，甲醛固定，石蜡包埋、切片。切片常规脱蜡至水；加入H2O2灭活内源性过氧化氢酶，滴加正常山羊血清工作液封闭，室温15 min，PBS冲洗。依次加入一抗小鼠抗Insulin抗体、HRP标记聚合物，PBS冲洗。DAB显色，苏木素复染，脱水，透明，封片。选择切片阳性表达最明显的区域，在40×10倍视野下，应用图像分析软件Image-Pro Plus6.0计算视野内阳性细胞的平均光密度(OD)值。胰岛素阳性细胞细胞核呈蓝色，周围染色呈棕黄色或棕褐色。

1.5.4胰腺组织定植示踪检测采用免疫组化法。应用MAB1281蛋白示踪剂，检测胰腺组织MAB1281蛋白表达进行hUCMSCs定植示踪。取胰腺组织，10%中性甲醛固定，石蜡包埋、切片。切片常规脱蜡至水；加入H2O2灭活内源性过氧化氢酶，滴加正常山羊血清工作液封闭，室温15 min，PBS冲洗。依次加入一抗MAB1281单克隆抗体、HRP标记聚合物，PBS冲洗。DAB显色，苏木素复染，脱水，透明，封片。于高倍镜下观察同一切片的5个不同视野，每个视野计数100个细胞，记录阳性细胞数量，计算阳性细胞表达率。MAB1281主要在细胞核表达，呈棕黄色。

2　结果

2.1胰腺组织病理学检查模型各组胰岛结构有不同程度破坏，胰岛细胞数量减少，形态不规则，细胞边界不清，部分发生空泡变性，胰岛边缘炎性细胞浸润明显。观察各组胰岛结构相对完整，胰岛体积稍大，炎症反应较轻。

2.2各组胰腺组织胰岛素mRNA表达比较模型尾静脉组、模型肝实质组、模型胰腺被膜组、观察尾静脉组、观察肝实质组、观察胰腺被膜组胰腺组织胰岛素mRNA表达量分别为0.296 2±0.037 5、0.280 1±0.027 3、0.313 6±0.044 7、0.645 6±0.059 9、0.547 2±0.053 2、1.005 5±0.094 5，观察各组胰腺组织胰岛素mRNA表达量高于模型各组(P<0.01)；观察胰腺被膜组胰腺组织胰岛素mRNA表达量高于观察尾静脉组及观察肝实质组(P均<0.01)。

2.3各组胰腺组织胰岛素蛋白表达比较观察各组胰岛组织胰岛素阳性面积大于模型各组，观察胰腺被膜组胰岛素阳性面积大于观察尾静脉组及观察肝实质组。

2.4胰腺组织定植示踪结果模型各组及观察肝实质组均未见阳性表达，观察尾静脉组及观察胰腺被膜组均可见阳性表达区域，且观察胰腺被膜组大于观察尾静脉组。

3　讨论

近年来，干细胞移植成为糖尿病治疗研究领域的热点。hUCMSCs作为一种从脐带华尔通胶中分离培养获得的成体干细胞，以较强的自我复制能力、多向分化潜能和较低的免疫原性备受关注[12]。多项研究表明，异种异体移植hUCMSCs能改善T1DM大鼠的高血糖状态及相关微血管病变[11,13]。目前干细胞移植主要采用胰腺被膜下或实质内、肾被膜下、肝实质内或肝门静脉、尾静脉等途径注射。胰腺被膜下注射可使干细胞直接进入胰腺组织，准确归巢到胰腺等靶部位以达到较好的治疗效果，但该器官位置隐蔽，对注射技术要求高；肾被膜下是免疫特许区, 血供丰富，可使移植细胞逃避免疫攻击，易于存活，但该部位不利于细胞分化。肝脏作为胰岛素的效应器官，有利于糖代谢调节，且其微环境更接近胰腺，温度适宜，血供丰富，利于干细胞定植、存活，但腹部手术切口大，存在感染风险；经尾静脉注射具有广泛分布的潜能，可重复应用并且创伤小，但干细胞通过其他组织器官的同时可能造成一定数量的破坏和局部分化，使得到达胰腺组织的干细胞数量较少。本课题组前期研究证实，hUCMSCs移植后糖尿病鼠血糖明显下降、血浆胰岛素水平增加，胰腺被膜下移植是hUCMSCs治疗糖尿病的最佳途径。Wang等[11]证实，尾静脉输注的hUCMSCs在糖尿病鼠肝脏和胰腺组织中定植，故本实验选用胰腺被膜下、肝实质内、尾静脉三种移植途径。有研究发现，在胚胎发育过程中，肝脏和胰腺具有同源性[14]，故肝脏部位较接近胰腺的组织微环境可能有利于干细胞定植、存活，使其在体内环境下产生血管内皮生长因子和胰岛素样生长因子等多种细胞因子，通过旁分泌作用与局部微环境影响，达到营养支持胰腺的功能。本研究发现，模型各组胰岛结构有不同程度破坏，胰岛细胞数量减少，细胞边界不清，部分发生空泡变性，而观察各组胰岛结构相对完整，胰岛体积稍大，炎症反应较轻，表明三种途径移植hUCMSCs可在一定程度上修复受损胰岛，减轻胰腺及外周组织的炎症反应，考虑经胰腺被膜下途径移植的hUCMSCs可迁移至胰腺组织内，直接刺激胰腺组织内的干细胞增殖，诱导内源性胰腺干细胞分化为胰岛β细胞；肝实质内移植的hUCMSCs可分泌多种细胞因子，改善胰腺微环境，促进体内残存胰岛素β细胞的增殖、再生和修复；尾静脉途径移植的hUCMSCs虽因全身血液循环中肺毛细血管管径较小导致其在各器官滞留，但仍有少量hUCMSCs到达胰腺和肝脏起治疗作用。

Tsai等[15]研究证实，hUCMSCs能够在体外分化为成熟的胰岛样细胞簇及胰岛素分泌细胞，移植入糖尿病模型鼠后，可使血胰岛素水平显著提高、血糖水平显著下降，考虑为分化细胞在胰腺组织进行分化，发挥代偿受损组织和分泌胰岛素的作用。本研究发现，观察各组胰腺组织胰岛素mRNA及蛋白表达量均高于模型各组，观察胰腺被膜组胰腺组织胰岛素mRNA及蛋白表达量均高于观察尾静脉组及观察肝实质组，表明胰腺被膜下移植hUCMSCs不仅可以保证胰腺局部hUCMSCs的数量，同时能使hUCMSCs直接、充分接触胰腺受损的微环境，感受局部损伤刺激，使其在诱导下分泌细胞因子，发挥其修复、促分化、营养、支持以及免疫调节等作用，使胰岛素表达增加，而肝实质内移植的hUCMSCs可分泌多种细胞因子，改善胰腺微环境，促进体内残存胰岛素β细胞的增殖、再生和修复，进而促进胰岛素分泌；对于尾静脉途径移植的hUCMSCs，因其于各器官滞留等原因，有少量hUCMSCs到达胰腺和肝脏等通过直接或间接途径不同程度增加胰岛素分泌。

综上，考虑三种途径移植的hUCMSCs在体内环境下产生血管内皮生长因子和胰岛素样生长因子等多种细胞因子，通过旁分泌作用与局部微环境影响，达到营养支持胰腺的功能；同时免疫因素参与其中，通过免疫调节作用减少因异常代谢所产生的免疫反应，组织胰岛β的渐进性破坏，同时减轻胰腺及外周组织的炎症反应，改善胰岛素抵抗，提高外周组织对胰岛素的敏感性，促进胰岛素分泌增加。

对移植细胞进行示踪可了解其是否在移植部位定植及存活。示踪干细胞方法包括荧光染料标记、核素标记、Y染色体标记、报告基因转染等，但均面临需移植前标记细胞、荧光易淬灭、示踪周期短或检测复杂等弊端。MAB1281单克隆抗体属于特异性抗人细胞核抗体，其阳性表达证明人类细胞于移植部位定植，目前国内外关于该抗体在移植细胞示踪中的应用研究较少。本研究发现，应用MAB1281单克隆抗体行免疫组化进行示踪时，模型各组及观察肝实质组均未见阳性表达，观察尾静脉组及观察胰腺被膜组均可见阳性表达区域，表明移植的hUCMSCs可于胰腺部位定植存活；观察胰腺被膜组面积大于观察尾静脉组，表明胰腺被膜下移植可保证更多的hUCMSCs存活，而尾静脉途径移植的hUCMSCs因于各器官滞留等原因，到达胰腺的细胞较少，说明病灶局部移植hUCMSCs是较好的途径。

综上所述，经胰腺被膜下、尾静脉等途径异种异体移植hUCMSCs细胞均可在大鼠体内胰腺组织中存活，虽肝实质内移植hUCMSCs无在胰腺组织中定植证据，但上述三种途径可增加胰腺组织的胰岛素表达，其中经胰腺被膜下移植是最佳的治疗途径，该途径可保证hUCMSCs于病灶局部定植，明显增加胰岛素表达，从而为糖尿病治疗研究提供实验基础。

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新乡医学院研究生科研创新支持计划项目(YJSCX20448Y)。

翁孝刚(E-mail: wengxiaogang@aliyun.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.30.013

R587.1

A

1002-266X(2016)30-0043-03

2015-12-04)