人胃癌组织Notch1表达及其意义



人胃癌组织Notch1表达及其意义

鉏莉1蔡陈效1*殷新光1邬万新2

嘉兴市第一医院消化内科(嘉兴市医学重点学科 胃肠病学)1(314000)病理科2

背景：胃癌是全球第四大常见恶性肿瘤。Notch信号通路在肿瘤发生机制中的作用为近年研究热点，但其在胃癌中的作用机制尚未完全明确。目的：探讨人胃癌组织中Notch1的表达情况及其意义。方法：纳入2011年10月—2014年7月嘉兴市第一医院收治的胃癌患者115例，采用免疫组化法检测癌组织和相应癌旁非癌组织标本中Notch1的表达情况，并分析Notch1表达与胃癌临床病理特征的关系。结果：Notch1在胃癌组织中的阳性表达率显著高于癌旁非癌组织(73.9%对 3.5%，P<0.001)。胃癌组织中的Notch1表达与肿瘤脉管浸润、淋巴结转移、TNM分期显著相关(P<0.05)。结论：Notch1作为促癌基因参与了胃癌的发生，并与胃癌浸润、转移有密切联系。

关键词胃肿瘤；Notch1；免疫组织化学；幽门螺杆菌

Expression and Significance of Notch1 in Human Gastric Cancer

CHULi1,CAIChenxiao1,YINXinguang1,WUWanxin2.

1DepartmentofGastroenterology,2DepartmentofPathology,JiaxingFirstHospital,Jiaxing,ZhejiangProvince(314000)

Correspondence to: CAI Chenxiao, Email: xccmail@163.com

Background: Gastric cancer (GC) is the fourth commonly seen cancer in the world. The role of Notch signaling pathway in the pathogenesis of tumors has become a focus in related studies, however, the underlying mechanism of Notch1 in GC has not yet been fully understood. Aims: To investigate the expression and significance of Notch1 in human GC tissue. Methods: A total of 115 patients with GC admitted at Jiaxing First Hospital from October 2011 to July 2014 were enrolled. Expression of Notch1 in cancerous tissue and para-cancer noncancerous tissue was determined by immunohistochemistry. The correlation between expression of Notch1 and clinicopathological characteristics of GC was analyzed. Results: Expression rate of Notch1 in cancerous tissue was significantly higher than that in para-cancer noncancerous tissue (73.9%vs. 3.5%,P<0.001). Notch1 expression in cancerous tissue was significantly correlated with depth of vascular involvement, lymph node metastasis and TNM stage of GC (P<0.05). Conclusions: Notch1 as a cancer-promoting gene is involved in the pathogenesis of GC, and has a close association with tumor invasion and metastasis.

Key wordsStomach Neoplasms;Notch1;Immunohistochemistry;Helicobacterpylori

胃癌是全球第四大常见恶性肿瘤，早期诊断率低，5年总体生存率仅为10%~40%[1-2]。我国是胃癌高发国家，发病率和死亡率分别占恶性肿瘤的第二和第三位，尽管近年来发病率呈下降趋势，但每年新发胃癌病例仍高达40万，死亡人数达30万[3]。胃癌的发生是多因素参与的多步骤复杂病理过程，受饮食、环境、幽门螺杆菌(Hp)感染、遗传等多种因素影响。近年来，Notch信号通路在肿瘤发生机制中的作用成为研究热点，并作为某些肿瘤(如白血病、乳腺癌)新的治疗靶点而备受关注[4-6]，但Notch1在胃癌中的表达及其作用机制尚未完全明确。本研究收集115例胃癌患者的癌组织和相应癌旁非癌组织标本，检测Notch1表达水平，并分析其表达在胃癌中的意义，以期为胃癌诊治提供理论依据。

材料与方法

一、标本获取

纳入2011年10月—2014年7月于嘉兴市第一医院行手术切除并经病理确诊的胃癌患者115例，其中男83例，女32例，年龄39~82岁，平均(60.34±8.78)岁。所有患者术前均未接受放化疗，临床病理资料和随访记录完整。收集患者术后胃癌组织和相应癌旁非癌组织(距癌组织边缘≥5 cm)标本。采集患者性别、年龄、肿瘤部位、大小、浸润深度、分化程度、脉管浸润、神经浸润、淋巴结转移、TNM分期、Hp感染等临床资料。研究方案经嘉兴市第一医院伦理委员会批准，患者或其家属签署知情同意书。

二、研究方法

Notch1免疫组化染色：采用免疫组化EnVision二步法检测胃癌组织和相应癌旁非癌组织中Notch1的表达和分布。石蜡包埋组织5 μm厚度连续切片，脱蜡和水化；切片入0.01 mol/L柠檬酸缓冲液(pH=6.0)，于微波炉内抗原修复20 min，室温冷却后PBS漂洗；3% H2O2封闭10 min，PBS漂洗；加入Notch1兔抗人单克隆抗体(1∶150)(购自英国Abcam公司)，4 ℃过夜；PBS漂洗，滴加二抗，37 ℃孵育1 h；PBS漂洗，DAB显色，自来水洗涤，苏木精复染，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树脂封片。以PBS代替一抗作为阴性对照，阳性对照由一抗试剂盒提供。

结果判定：Notch1免疫组化染色阳性物质定位于细胞质，胞质出现棕黄色或棕褐色染色判定为阳性细胞。由2名病理医师进行独立双盲评分。每例标本于光学显微镜下随机选取5个200倍视野，判读视野中Notch1染色范围和染色强度，进行半定量评分，结果取均值。评分标准参考张勇等[7]的研究：①染色范围计分：阳性细胞数占细胞总数比率<5%、6%~25%、26%~50%、51%~75%、>75%分别记0、1、2、3、4分；②染色强度计分：无染色、淡黄色、棕色、棕褐色分别记0、1、2、3分。总分为染色范围计分与染色强度计分的乘积：0分为阴性；1~4分为(+)；5~8分为(++)；9~12分为(+++)。1~4分为低表达，5~12分为高表达。

三、统计学分析

应用SPSS 16.0统计软件。计数资料以百分率表示，组间比较采用χ2检验；Notch1表达与胃癌临床病理特征关系的分析采用χ2检验或Fisher确切概率法。P<0.05 为差异有统计学意义。

结果

一、Notch1表达和分布

Notch1阳性染色物质主要定位于细胞质，呈黄色至棕色颗粒(图1)。胃癌组织中Notch1阳性表达率为73.9%(85/115)，其中25.2%(29/115)为低表达，48.7%(56/115)为高表达，26.1%(30/115)呈阴性。癌旁非癌组织中Notch1阳性表达率仅为3.5%(4/115)，均为低表达。Notch1在胃癌组织中的阳性表达率显著高于癌旁非癌组织(P<0.001)。

图1胃癌组织Notch1蛋白表达(免疫组化EnVision二步法，×200)

二、Notch1表达与胃癌临床病理特征的关系

胃癌组织中的Notch1表达与肿瘤脉管浸润、淋巴结转移、TNM分期显著相关(P<0.05)，与患者性别、年龄、肿瘤部位、大小、浸润深度、分化程度、神经浸润、Hp感染无关(P>0.05)。有脉管浸润、淋巴结转移以及TNM Ⅲ期的胃癌患者，其Notch1阳性表达率分别显著高于无脉管浸润、无淋巴结转移以及TNM Ⅰ、Ⅱ 期患者，TNM分期越晚，Notch1阳性表达率越高(Kappa=0.036，P<0.05)(表1)。

讨论

Notch基因于1917年在果蝇体内首次发现，因该基因部分缺失可致果蝇翅缘部分缺失而得名[8]。Notch广泛表达于从无脊椎动物到哺乳动物的多个物种，是一个在进化上十分保守的跨膜受体蛋白家族[9]。1991年在人类T细胞白血病中发现Notch1，提示Notch信号通路与肿瘤发生相关[10]。

Notch信号通路是调节细胞增殖和凋亡的信号转导系统，由受体、配体和DNA结合蛋白三部分组成。哺乳动物中共有Notch1~4四种Notch受体，以及五种相应配体，包括delta样配体(DLL)1、3、4和Jagged-1、Jagged-2[11]。Notch受体广泛分布于造血干细胞、胚胎干细胞、淋巴细胞、血管内皮细胞等多种细胞表面。

表1　Notch1表达与胃癌临床病理特征的关系n(%)

Notch信号通路异常与某些肿瘤的发生有关，异常表达的Notch具有调控肿瘤细胞生长、代谢以及细胞周期等作用[12]。在不同组织起源的肿瘤或同种肿瘤的不同阶段，Notch信号通路可发挥抑制或促进肿瘤的作用。在绝大多数肿瘤中，Notch信号通路发挥促癌作用，如T细胞白血病、结直肠癌、乳腺癌等[4,13-14]。在小部分肿瘤中，Notch信号通路发挥抑癌作用，如甲状腺癌、非小细胞肺癌等[15-16]。

Notch信号通路在胃癌发生中的作用目前尚未完全明确，但已有研究发现胃癌组织中Notch表达水平明显增高。Yeh等[17]的研究发现，胃癌组织中的Notch1表达与肿瘤大小、病理分级、浸润深度、远处转移相关，Notch1可通过环氧合酶-2促进癌巢形成。李大卫等[18]通过高通量组织芯片技术证实Notch1在胃癌组织中高表达，其与下游NF-κB组成的信号通路可能参与了胃癌的发生、侵袭、浸润等恶性生物学行为；进一步行多因素生存分析，发现Notch1可作为预测胃癌患者生存和预后的指标。Du等[19]对15项基于胃癌Notch通路的临床研究(共1 547例胃癌患者)行meta分析，发现Notch1在胃癌组织中的表达显著高于正常组织；进一步的分析显示，Notch1表达与肿瘤部位、大小、Lauren分型、淋巴结转移、远处转移相关，而与患者性别、年龄、肿瘤分化程度、临床分期无关。然而，亦有研究[20]发现Notch1在胃癌组织中的表达低于癌旁非癌组织，认为Notch1在胃癌发生中可能起抑癌基因的作用。

本研究结果显示，胃癌组织中的Notch1阳性表达率高达73.9%，而癌旁非癌组织阳性表达率仅为3.5%。对胃癌组织中的Notch1阳性表达率与胃癌临床病理特征行相关性分析，发现Notch1表达与肿瘤脉管浸润、淋巴结转移、TNM分期显著相关，提示Notch1作为促癌基因参与了胃癌的发生，并与胃癌浸润、转移有密切联系。

Hp作为 Ⅰ 类致癌原，与胃癌的关系已得到广泛研究，但具体致癌机制仍未完全明确。尽管有研究发现Jagged1、NF-κB在Hp感染相关胃黏膜慢性炎症等病变中表达上调[21-22]，但赵娜等[23]的研究显示胃癌组织中Notch1、Jagged1和NF-κB异常表达均与Hp感染无关。本研究中胃癌患者的Hp感染率为33.0%，相关性分析显示胃癌组织中的Notch1表达与Hp感染无关，提示Notch1参与胃癌发生的机制可能并非通过Hp感染引起胃黏膜癌变。目前普遍认为Hp感染主要作用于胃癌发生的早期阶段，当胃癌发展至进展期后，由于涉及多种遗传物质和信号转导通路的改变，Hp的影响逐渐减弱。

综上所述，本研究探索了胃癌组织中Notch1的表达情况及其与胃癌临床病理特征的关系，研究结果显示Notch1参与了胃癌的发生、浸润、转移。有研究[17-18]指出，Notch1可作为胃癌预后的独立预测因子，其高表达提示预后不良，因此Notch1有可能成为一个新的肿瘤标记物，有助于完善现有胃癌预后评估系统，亦可能成为胃癌治疗的新靶点。此外，有研究指出DLL4-Notch1信号通路在肿瘤血管生成中发挥重要调节作用[24]，Notch1高表达可促进CD44+胃癌干细胞增殖[25]，但目前关于Notch1在这些过程中的具体作用机制尚未阐明，有待进一步探索。

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(2015-07-19收稿；2015-08-29修回)

DOI:10.3969/j.issn.1008-7125.2016.01.007

*本文通信作者，Email: xccmail@163.com