TRAIL对人胃癌耐药细胞株SGC-7901/VCR多药耐药基因GST-π表达的影响



TRAIL对人胃癌耐药细胞株SGC-7901/VCR多药耐药基因GST-π表达的影响

王慧群*张开光#王俊先王巧民

安徽省立医院消化内科(230001)

背景：肿瘤细胞的多药耐药现象是导致进展期胃癌化疗失败的重要因素之一。肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)能增强化疗药物对肿瘤细胞的杀伤作用，并逆转耐药细胞株为敏感细胞株，但其确切机制尚不清楚。目的：研究TRAIL对人胃癌耐药细胞株SGC-7901/VCR多药耐药基因谷胱甘肽硫转移酶-π(GST-π)表达的影响，探讨其逆转胃癌细胞多药耐药的可能机制。方法：以不同浓度TRAIL(50、100、200、400 μg/L)干预SGC-7901/VCR细胞48 h，采用RT-PCR和ELISA法检测各组SGC-7901/VCR细胞中的GST-π mRNA表达和细胞培养上清液中的GST-π含量。结果：TRAIL干预能抑制SGC7901/VCR细胞的GST-π mRNA表达及其蛋白分泌，抑制作用在一定剂量范围内(≤200 μg/L)具有量效关系。50、100、200、400 μg/L TRAIL组GST-π mRNA相对表达量分别为0.89±0.04、0.77±0.08、0.65±0.06和0.61±0.03，细胞培养上清液中的GST-π含量分别为(57.56±1.19) ng/mL、(56.30±0.80) ng/mL、(31.41±1.65) ng/mL和(30.80±1.34) ng/mL，均低于对照组的1.01±0.13和(58.62±1.38) ng/mL，差异有统计学意义(P<0.05)。结论：TRAIL可能通过下调GST-π表达参与了胃癌细胞多药耐药的逆转。

关键词胃肿瘤；TNF相关凋亡诱导配体；谷胱甘肽转移酶；多药耐药

Effect of TRAIL on Expression of Multidrug Resistance Gene GST-π in Drug-resistant Human Gastric Cancer Cell Line SGC7901/VCRWANGHuiqun,ZHANGKaiguang,WANGJunxian,WANGQiaomin.DepartmentofGastroenterology,AnhuiProvincialHospital,Hefei(230001)

Correspondence to: ZHANG Kaiguang, Email: zhangkaiguang@medmail.com.cn

Background: Multidrug resistance of tumor cells is one of the important factors that cause failure of chemotherapy in advanced gastric cancer. Tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand (TRAIL) may enhance the killing effect of chemotherapeutics on tumor cells, and reverse drug-resistant cell lines to sensitive cell lines, but its mechanism is not yet clear. Aims: To study the effect of TRAIL on expression of multidrug resistance gene glutathione S-transferase-π (GST-π) in drug-resistant human gastric cancer cell line SGC-7901/VCR and the potential mechanism of TRAIL in reversing multidrug resistance of gastric cancer cells. Methods: SGC-7901/VCR cells were treated with TRAIL in different doses (50, 100, 200 and 400 μg/L) for 48 hours. After treatment, expression of GST-π mRNA in SGC-7901/VCR cells and concentration of GST-π in culture supernatant were detected by RT-PCR and ELISA, respectively. Results: TRAIL could inhibit mRNA expression and protein secretion of GST-π in SGC-7901/VCR cells in a dose-dependent manner within a certain range (≤200 μg/L). The relative expression levels of GST-π mRNA in 50, 100, 200 and 400 μg/L TRAIL groups were 0.89±0.04, 0.77±0.08, 0.65±0.06 and 0.61±0.03, respectively, and the concentrations of GST-π in culture supernatant in these groups were (57.56±1.19) ng/mL, (56.30±0.80) ng/mL, (31.41±1.65) ng/mL and (30.80±1.34) ng/mL, respectively, all were significantly lower than those in control group [1.01±0.13 and (58.62±1.38) ng/mL,Pall <0.05]. Conclusions: TRAIL may play a potential role in reversing multidrug resistance of gastric cancer cells through down-regulating GST-π expression.

Key wordsStomach Neoplasms;TNF-Related Apoptosis-Inducing Ligand;Glutathione Transferase;Multidrug Resistance

胃癌是消化系统最常见的恶性肿瘤[1]，化疗是胃癌尤其是进展期胃癌的重要治疗手段，而肿瘤细胞的多药耐药(multidrug resistance)现象是导致胃癌化疗失败的重要因素之一。因此，研究多药耐药的发生机制及其影响因素对寻求逆转多药耐药的对策具有重要意义。肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand, TRAIL)能增强化疗药物对肿瘤细胞的杀伤作用，并逆转耐药细胞株为敏感细胞株[2-3]，但其确切机制尚不清楚。有研究[4-6]发现抑制肿瘤细胞多药耐药基因表达可有效逆转多药耐药，增加对化疗药物的敏感性，由此推测TRAIL亦可能通过影响多药耐药基因表达而发挥化疗增敏作用。谷胱甘肽硫转移酶(glutathione S-transferase, GST)是一组具有解毒和代谢功能的酶类，在各类GST中，以GST-π占比最高，与肿瘤细胞多药耐药的关系最为密切，在耐药肿瘤细胞中呈高表达[7]。本实验以TRAIL为干预因素，观察其对人胃癌耐药细胞株SGC-7901/VCR多药耐药基因GST-π表达的影响，探讨TRAIL逆转胃癌细胞多药耐药的可能机制，以期为胃癌化疗提供新的思路。

材料与方法

一、细胞株和主要试剂

人胃癌耐药细胞株SGC-7901/VCR由第四军医大学西京医院全军消化病研究所樊代明教授惠赠。长春新碱(VCR，深圳万乐药业有限公司)，TRAIL(PeproTech)，TRIzol®RNA分离试剂、第一链cDNA合成试剂盒、PCR试剂盒(Thermo Fisher Scientific)，GST-π和β-actin引物设计、合成[生工生物工程(上海)股份有限公司]，GST-π ELISA试剂盒(R&D Systems, Inc.)。

二、方法

1. 细胞培养：SGC-7901/VCR细胞置于37 ℃、50 mL/L CO2、饱和湿度条件恒温培养箱内培养，培养液为RPMI-1640完全培养基(含100 mL/L FBS、青霉素100 U/mL、链霉素100 μg/mL)，并常规加入1.0 μg/mL VCR以维持细胞耐药性，实验前2周撤药。

2. TRAIL配制：按试剂说明书将TRAIL溶于100 μL ddH2O中，配制成100 mg/L溶液，-20 ℃保存，实验当天以培养基稀释至所需浓度。

3. 细胞处理：取对数生长期SGC-7901/VCR细胞，以每孔1×108/L接种于25 cm×25 cm培养瓶中，待细胞生长至70%~80%，更换新鲜培养基，分别加入终浓度为50、100、200、400 μg/L的TRAIL，另设不予TRAIL干预、仅加入培养基的对照组。每24 h换液一次以维持药物浓度，培养48 h后分别收集各组细胞，用于后续实验。每一组别设3个复孔，实验结果取均值。

4. RT-PCR：分别收集各组细胞1×109，以TRIzol®RNA分离试剂提取总RNA，经鉴定所提取的总RNA样本纯度和完整性符合实验要求。取总RNA 2 μg，以第一链cDNA合成试剂盒合成cDNA。逆转录反应体系：总RNA 2 μg，Oligo(dT) 1 μL，5×缓冲液4 μL，RNase抑制剂1 μL，10 mmol/L dNTP 2 μL，M-MuLV逆转录酶1 μL，以去离子水补足至20 μL。反应条件：42 ℃ 1 h，70 ℃ 5 min，4 ℃ 10 min。取逆转录反应产物2 μL，以β-actin为内参行PCR扩增。GST-π引物序列：F 5’-CCC AAG TTC CAG GAC GGA GAC-3’，R 5’-TCA GCA GCA AGT CCA GCA GGT-3’，扩增片段长度325 bp[8]；β-actin引物序列：F 5’-TCC TGT GGC ATC CAC GAA ACT-3’，R 5’-GAA GCA TTT GCG GTG GAC GAT-3’，扩增片段长度314 bp[9]。PCR反应体系：PCR master mix 12.5 μL，上游、下游引物各1 μL，cDNA 2 μL，以去离子 水补足至25 μL。在Applied Biosystems®GeneAmp®9700 PCR系统中行PCR扩增。反应条件：GST-π 94 ℃ 5 min；94 ℃ 45 s，55 ℃ 45 s，72 ℃ 60 s，35个循环；72 ℃ 10 min。扩增产物经0.2%琼脂糖凝胶电泳，以天能GIS-2010数码凝胶图像分析系统对GST-π mRNA表达行半定量分析(GST-π mRNA/β-actin mRNA)。

5. ELISA：各组细胞培养48 h后，分别吸取培养上清液500 μL，3 000 r/min离心5~10 min，去除细胞碎片。将上清液加入已包被抗体的96孔板中，按ELISA试剂盒说明书进行操作。最后于酶标仪450 nm处读取各样本A值，根据标准蛋白浓度和相应A值绘制标准曲线，计算GST-π含量。

三、统计学分析

结果

一、各组SGC7901/VCR细胞GST-π mRNA表达

RT-PCR检测结果显示，与对照组相比，经不同浓度TRAIL干预48 h的SGC7901/VCR细胞，GST-π mRNA表达受到不同程度的抑制，50、100、200、400 μg/L TRAIL组相对表达量分别为0.89±0.04、0.77±0.08、0.65±0.06和0.61±0.03，均低于对照组的1.01±0.13，除200 μg/L与400 μg/L组间，各组间两两比较差异均有统计学意义(P<0.05)，表明TRAIL对SGC7901/VCR细胞GST-π mRNA表达的抑制作用在一定剂量范围内(≤200 μg/L)具有量效关系(图1)。

M：DNA Marker；泳道1~5：对照组和50、100、200、400 μg/L TRAIL组；泳道a~e：与泳道1~5对应的β-actin

图1不同浓度TRAIL干预对SGC7901/VCR细胞GST-π mRNA表达的影响

二、各组SGC7901/VCR细胞培养上清液GST-π含量

ELISA检测结果显示，与对照组相比，经不同浓度TRAIL干预48 h的SGC7901/VCR细胞，细胞培养上清液中的GST-π含量有不同程度的降低，50、100、200、400 μg/L TRAIL组GST-π含量分别为(57.56±1.19) ng/mL、(56.30±0.80) ng/mL、(31.41±1.65) ng/mL和(30.80±1.34) ng/mL，均低于对照组的(58.62±1.38) ng/mL，除200 μg/L与400 μg/L组间，各组间两两比较差异均有统计学意义(P<0.05)，表明TRAIL对SGC7901/VCR细胞GST-π蛋白分泌的抑制作用在一定剂量范围内(≤200 μg/L)具有量效关系。

讨论

肿瘤细胞耐药性的产生是一个多因素参与的复杂过程，现已确认耐药基因的激活和表达上调与肿瘤耐药有密切联系[10]。GST-π是一种分布于细胞质中的重要Ⅱ相解毒酶类，其解毒功能与肿瘤细胞多药耐药关系密切，可催化还原型谷胱甘肽(GSH)与亲电子物质结合，使细胞毒性药物代谢成无毒性物质，并可直接与亲脂性药物结合，通过增加药物的水溶性而促使其排出细胞外，同时可将化疗药物产生的过氧化物还原为无毒性物质，从而降低药物疗效[11]，可作为肿瘤耐药的独立影响因素。研究发现GST-π在胃癌组织中呈高表达[8-9]，而抑制GST-π表达可提高肿瘤细胞对化疗药物的敏感性，从而延长患者生存期[6]。

TRAIL是肿瘤坏死因子(TNF)家族成员，能通过与死亡受体结合诱导多种肿瘤细胞凋亡，对正常细胞则无明显毒性作用，这一特性使其在肿瘤靶向治疗方面显现出良好的应用前景[2-3,12-13]。TRAIL与细胞膜上的相应死亡受体TRAIL-R1、TRAIL-R2结合后激活caspases通路，传递和放大凋亡信号，诱导靶细胞发生快速、大量、高效的凋亡反应。此外，研究[14]还发现TRAIL如与化疗药物联合使用，对肿瘤细胞的杀伤效应较两者单用显著增强，但其增加肿瘤细胞化疗敏感性的作用机制尚不明确。据相关文献报道，TNF逆转肿瘤细胞多药耐药的可能机制主要有[15-16]：①下调P-糖蛋白(P-gp)编码基因多药耐药基因1(MDR1)表达，减少细胞内化疗药物蓄积，从而逆转由P-gp引起的经典多药耐药；②下调GST-π表达，通过降低细胞内解毒功能逆转多药耐药。TRAIL作为TNF家族成员之一，其逆转肿瘤细胞多药耐药的机制是否与TNF类似，目前国内外相关文献报道尚少。本课题组前期研究[17]已发现TRAIL可抑制人胃癌耐药细胞株SGC-7901/VCR中的MDR1/P-gp表达，且抑制作用在一定剂量范围内具有量效关系。本研究进一步探讨了TRAIL逆转胃癌细胞多药耐药的作用与GST-π的关系。实验结果显示，在SGC-7901/VCR细胞中，TRAIL可在转录和翻译水平抑制多药耐药基因GST-π表达，抑制作用具有良好的量效关系，但此种量效关系并不呈线性关系，TRAIL浓度>200 μg/L 后，GST-π表达不再进一步降低，分析其原因可能为该胃癌细胞株本身对TRAIL有一定耐药性。刘玲等[18]关于TRAIL对SGC-7901细胞生长抑制和凋亡诱导作用的实验研究发现，TRAIL浓度>200 μg/L后，细胞生长抑制率即不再明显增加，TRAIL浓度>500 μg/L时，细胞生长抑制率和凋亡率均不超过30%，提示SGC-7901细胞为TRAIL耐药细胞株，与本实验结果相符。

综上所述，根据本实验结果可初步推测 TRAIL与胃癌细胞多药耐药之间存在负相关关系，其可能通过下调多药耐药基因GST-π表达参与了胃癌细胞多药耐药的逆转。为了更深入地研究TRAIL对胃癌细胞多药耐药的逆转作用，后续拟联合应用TRAIL与化疗药物，观察TRAIL 对胃癌细胞多药耐药基因表达和化疗药物疗效的影响，探讨TRAIL下调多药耐药基因表达具体机制的相关研究亦已在进行中。

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(2015-05-26收稿；2015-06-05修回)

DOI:10.3969/j.issn.1008-7125.2016.01.003

*Email: wanghuiqun1986@126.com

#本文通信作者， Email: zhangkaiguang@medmail.com.cn