模拟肾虚痰湿特征信息PCOS大鼠模型中GDF-9、BMPR-2的表达研究❋

邓蒂斯，徐晓娟，姚莉娟，王张，黄立华，李宛静，何蕴良

(成都中医药大学，成都610075)

模拟肾虚痰湿特征信息PCOS大鼠模型中GDF-9、BMPR-2的表达研究❋

邓蒂斯，徐晓娟△，姚莉娟，王张，黄立华，李宛静，何蕴良

(成都中医药大学，成都610075)

目的:探讨生长分化因子-9(GDF-9)及骨形态发生蛋白受体-2(BMPR-2)在有肾虚痰湿特征信息的肥胖多囊卵巢综合征(PCOS)大鼠模型的卵巢颗粒细胞中的表达。方法:分别在来曲唑(Letrozole)和脱氢表雄酮(DHEA)造模基础上加用高脂乳剂，建立肥胖PCOS动物模型，结合阴道脱落细胞涂片、大鼠体质量增加幅度、血脂水平和卵巢形态学的改变进行模型验证，选用免疫组化法检测大鼠模型卵巢组织卵泡颗粒细胞中GDF-9、BMPR-2的表达。结果:模型建立成功，Letrozole模型组、Letrozole肥胖模型组GDP-9积分光密度总和均显著低于高脂模型组。此外，Letrozole肥胖模型组GDP-9平均灰度均值低于高脂模型组，DHEA模型组和DHEA肥胖模型组GDF-9积分光密度总和均显著高于空白对照组，Letrozole模型组BMPR-2积分光密度总和均显著高于高脂模型组，DHEA模型组BMPR-2积分光密度总和显著高于高脂模型组。结论:推测GDF-9、BMPR-2在肥胖PCOS大鼠模型卵巢的卵泡颗粒细胞中表达降低可能是肥胖PCOS发生发展的重要原因。

生长分化因子-9;骨形态发生蛋白受体-2;肾虚痰湿特征信息;肥胖PCOS大鼠模型;颗粒细胞

多囊卵巢综合征(polycystic ovarian syndrome， PCOS)是涉及多器官、多系统的以排卵障碍、高雄激素血症和(或)胰岛素抵抗(IR)为特征的内分泌紊乱性疾病，临床表现可见高度多样化，其病理机制尚无定论［1］。李琴华等［2］指出，38%～88%的PCOS患者都伴有体质量超标或肥胖，肥胖型PCOS患者伴有代谢综合征的风险明显高于非肥胖型PCOS患者。最近研究表明，卵巢病理改变的重要原因是卵巢局部微环境紊乱和细胞因子表达及功能异常，卵母细胞分泌的生长分化因子-9(GDF-9)与卵泡生长发育密切相关，推测GDF-9表达发生变化也许是导致本病患者卵泡发育异常的原因之一［3-4］。骨形态发生蛋白受体-2(BMPR-2)主要表达于颗粒细胞和卵泡膜细胞，主要通过与GDF-9结合起作用［5］。GDF-9和BMPR-2都是卵泡生长发育和卵巢功能的重要调节因子，均经由自分泌和旁分泌机制对卵巢局部细胞的分化、增殖和其他功能进行调节，从而达到对优势卵泡形成和卵母细胞成熟的调控［6-7］。本研究系对GDF-9和BMPR-2在肥胖PCOS动物模型卵丘颗粒细胞的蛋白表达进行探索性研究，旨在探讨卵源性因子在PCOS卵泡发育异常机制中的作用。

1 材料与方法

1.1 动物与试剂

6周龄清洁级SD雌性大鼠36只，体质量100～120 g，购于成都达硕生物科技有限公司(生产许可证号SCXK(川)2013-24，生产批号0018284)。饲养条件:环境温度为20℃～24℃，湿度40%～70%，每天阳光下照射10 h，自由饮水，进食颗粒饲料。来曲唑(Letrozole)购于江苏恒瑞医药股份有限公司(生产批号14030657)，脱氢表雄酮(DHEA)购于美国IL公司，注射用油购于天津市北辰方正试剂厂(生产批号201407)，胆固醇购自河南兴源化工产品有限公司(20140524)。兔抗鼠GDP-9多克隆抗体(BA1288，生产批号59000)和兔抗鼠BMPR-2多克隆抗体(BA2820-1，生产批号D-B1-08E07A)购于博士德生物有限公司。

1.2 分组与建立改良PCOS动物模型采用随机数字表法将大鼠分为空白对照组、高脂模型组、Letrozole模型组、Letrozole联合高脂模型组(简称Letrozole肥胖模型组)、DHEA模型组和DHEA联合高脂模型组(简称DHEA肥胖模型组)6组各6只，分笼喂养。造模方法:空白对照组大鼠行颈部皮下注射生理盐水0.2 ml，同时灌胃浓度10 mg/ml的羧甲基纤维素溶液(CMC)13 ml/kg·d;高脂模型组大鼠灌胃高脂乳剂(猪油+胆固醇，猪油∶胆固醇=10∶3)15 ml/kg·d;Letrozole模型组大鼠灌胃Letrozole1 ml/kg·d;Letrozole肥胖模型组大鼠灌胃Letrozole1 ml/kg·d及灌胃高脂乳剂15 ml/kg·d;DHEA模型组大鼠皮下注射DHEA 60 ml/kg·d;DHEA肥胖模型组大鼠皮下注射DHEA 60 ml/kg·d及灌胃高脂乳剂15 ml/kg·d。连续21 d于早上9时开始造模处理。

1.3 大鼠动情周期检测

自造模处理第10天起，各组每天开始进行阴道涂片，用生理盐水浸泡消毒棉拭子放入大鼠阴道逆时针旋转，取出后涂片。涂片自然风干后行巴氏染色法染色。镜下连续观察动情周期的变化2个周期，1个动情周期为5 d。

1.4 卵巢标本处理

造模处理第22天以苯巴比妥钠麻醉大鼠。取出双侧卵巢，左侧用福尔马林、醋酸、酒精固定液(FAA)固定48 h，逐级酒精脱水，后用二甲苯透明、浸腊，以卵巢最大平面为待测面，常规石蜡包埋，制成4 μm厚切片，在Mias-2000图形分析系统(四川大学图像图形研究所)下定量观察。将右侧卵巢迅速置入－80℃保存。

1.5 体质量与血脂检测

测量体质量，股动脉取血分离血清。采用全自动生化分析仪检测甘油三酯(TG)、胆固醇(TC)后，颈椎脱臼处死大鼠。

1.6 免疫组织化学检测

将左侧卵巢冷藏后进行石蜡切片脱蜡至水。室温条件下孵育10 min，去除内源性过氧化物酶活性。蒸馏水冲洗，PBS浸泡5 min。用PBS稀释的10%正常山羊血清封闭，室温条件下孵育10 min。倾去血清，滴加稀释的一抗(稀释倍数1∶100)，4℃过夜。PBS冲洗3×5 min，滴加生物素标记的二抗工作液，室温30 min，PBS3×5 min。滴加辣根酶标记链霉卵白素工作液，室温孵育30 min，PBS 3×5 min，DAB显色。自来水充分冲洗、复染、封片。一抗由PBS代替为阴性对照，卵巢组织颗粒细胞呈现棕黄色颗粒为阳性信号。每张切片随机选定5个区域，分别测定阳性细胞的平均灰度，再取平均值分别反映该卵巢组织中GDF-9和BMPR-2蛋白质表达水平。取10ul PCR产物，用2%琼脂糖凝胶行电泳，应用凝胶图像分析处理系统扫描并计算积分光密度。

1.7 统计学方法

采用PEMS 3.1统计软件进行统计分析，计量数据以均数±标准差(±s)表示，多组间比较采用单因素方差分析，P＜0.01，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 动情周期变化

表1显示，空白对照组大鼠阴道涂片均保持规律的4 d动情周期的变化。高脂模型组大鼠阴道涂片示动情前期、动情期及间期交替出现。Letrozole模型组大鼠动情周期紊乱，阴道涂片示持续4 d处于动情间期。DHEA模型组和DHEA肥胖模型组大鼠失去正常动情周期，阴道涂片示持续处于动情前期和动情期。

2.2 体质量增长幅度变化

表2显示，高脂模型组大鼠的体质量增长幅度显著高于空白对照组(P＜0.05)。Letrozole模型组、Letrozole肥胖模型组、DHEA模型组和DHEA肥胖模型组大鼠的体质量增长幅度均极显著高于空白对照组和高脂模型组(P＜0.01)。Letrozole模型组的体质量增长幅度低于Letrozole肥胖模型组大鼠，DHEA模型组大鼠的体质量增长幅度低于DHEA肥胖模型组，差异无统计学意义(P＞0.05)。

表1 大鼠动情周期及排卵情况

2.3 血脂水平

表2显示，Letrozole肥胖模型组大鼠的TC极显著高于空白对照组、高脂模型组和Letrozole模型组(P＜0.01)。Letrozole模型组大鼠的TG显著高于空白对照组。Letrozole肥胖模型组大鼠的TG显著高于空白对照组、高脂模型组和Letrozole模型组(P＜0.05)。DHEA模型组TC、TG显著高于空白对照组(P＜0.01)。DHEA肥胖模型组大鼠的TC极显著高于空白对照组、高脂模型组和DHEA模型组(P＜0.01)。DHEA肥胖模型组大鼠的TG极显著高于空白对照组，高于高脂模型组和DHEA模型组(P＜0.05)。

表2 大鼠体质量增加幅度和血脂水平表(±s)

表2 大鼠体质量增加幅度和血脂水平表(±s)

注:与空白对照组比较:*P＜0.05，＊＊P＜0.01;与高脂模型组比较:△P＜0.05，△△P＜0.01;与Letrozole模型组比较:▲P＜0.05，▲▲P＜0.01;与DHEA模型组比较:#P＜0.05

组别鼠数体质量增加幅度(g)TC(mmol/L)TG(mmol/L) 54.12±10.23 1.42±0.22 0.75±0.19高脂模型组6 67.87±9.71*1.54±0.14 0.81±0.10 Letrozole模型组6 83.45±9.65＊＊△△1.63±0.18 0.98±0.15＊＊Letrozole肥胖模型组6 85.78±11.86＊＊△△2.01±0.23＊＊△△▲▲1.09±0.09＊△▲DHEA模型组6 80.42±9.80＊＊△△1.91±0.10＊＊0.93±0.08＊＊DHEA肥胖模型组6 82.59±9.73＊＊△△2.31±0.31＊＊△△▲▲1.05±0.17＊＊△#空白对照组6

2.4 卵巢HE染色

空白对照组大鼠卵巢表面较红，HE染色后在光镜下观察到发育时期各不相同的初级卵泡、次级卵泡、成熟卵泡、黄体和白体。其余各造模组大鼠卵巢表面苍白，HE染色后在光镜下观察，高脂模型组大鼠可见闭锁卵泡和囊状卵泡数量增多，同时可见少量的黄体和白体。Letrozole模型组、Letrozole肥胖模型组、DHEA模型组、DHEA肥胖模型组分别行HE染色法，光镜下大鼠卵巢的次级卵泡数量减少，而囊状卵泡和闭锁卵泡增多，未见排卵前的成熟卵泡，同时可见黄体和白体明显减少。

2.5 GDF-9及BMPR-2在PCOS卵巢中表达

图1、2显示，GDF-9免疫组化法检测显示，空白对照组大鼠卵巢结构完整，正常的初级卵泡、次级卵泡是GDF-9主要表达的部位。其余各模型组卵巢组织结构紊乱，可见大量闭锁卵泡及囊状扩张的卵泡，在颗粒细胞层中可见少许GDF-9分布。BMPR-2免疫组化法检测显示，空白对照组BMPR-2主要表达于发育正常的始基卵泡、初级卵泡和小窦卵泡中。其余各模型组BMPR-2在始基卵泡、初级卵泡表达降低，同样在小窦卵泡达到较高水平。

图1 卵巢组织GDF-9蛋白的免疫组织化学染色结果(×100)

Letrozole模型组和Letrozole肥胖模型组GDF-9积分光密度总和显著低于高脂模型组(P＜0.05)。Letrozole肥胖模型组GDF-9平均灰度均值均低于高脂模型组(P＜0.05)。DHEA模型组和DHEA肥胖模型组GDF-9积分光密度总和显著高于空白对照组(P＜0.05)。DHEA模型组和DHEA肥胖模型组GDF-9平均灰度均值低于空白对照组和高脂模型组，差异无统计学意义(P＞0.05)。Letrozole造模法可致肥胖PCOS大鼠积分光密度总和降低，DHEA造模法则发现肥胖PCOS大鼠积分光密度总和升高。然而所有的PCOS大鼠平均灰度均值均降低，表明GDF-9在肥胖PCOS动物模型中的表达降低。Letrozole模型组BMPR-2积分光密度总和显著高于高脂模型组(P＜0.05)。Letrozole模型组和Letrozole肥胖模型组BMPR-2平均灰度均值低于空白对照组和高脂模型组，差异无统计学意义(P＞0.05)。DHEA模型组BMPR-2积分光密度总和显著高于高脂模型组(P＜0.05)。DHEA模型组和DHEA肥胖模型组BMPR-2平均灰度均值均低于空白对照组和高脂模型组，差异无统计学意义(P＞0.05)。Letrozole造模法、DHEA造模法可致PCOS大鼠积分光密度总和升高，平均灰度均值均降低，表明BMPR-2在PCOS动物模型中表达降低。

图2 卵巢组织BM PR-2蛋白的免疫组织化学染色结果(×100)

表3 GDF-9及BM PR-2在肥胖PCOS动物模型中的表达(±s)

表3 GDF-9及BM PR-2在肥胖PCOS动物模型中的表达(±s)

注:与空白对照组比较:*P＜0.05;与高脂模型组比较:△P＜0.05

组GDF-9 BMPR-2别鼠数积分光密度总和平均灰度均值积分光密度总和平均灰度均值空白对照组6 15558.84±3119.70 116.68±8.06 18997.81±26 114.99±6.25 26816.42±8641.28 101.93±7.91 28.27 108.31±4.25高脂模型组6 18085.17±4407.14 116.55±3.40 14645.58±4019.42 106.93±3.49 Letrozole模型组6 12721.82±3980.68△110.73±3.98 22687.59±5037.26△102.41±7.55 Letrozole肥胖模型组6 12577.38±2154.50△109.06±3.10△18510.97±5097.50 105.69±3.73 DHEA模型组6 23586.88±5446.42*113.67±4.70 31012.49±16751.53△105.56±10.86 DHEA肥胖模型组6 21332.98±4380.13*

3 讨论

课题组前期研究发现，DHEA造模、芳香化酶抑制剂造模均可出现体质量增加，卵巢质量、卵巢体积增加，促黄体生成素、促卵泡生成素、睾酮升高，胰岛素抵抗及卵巢呈现多囊样改变。DHEA造模卵巢无论是组织形态学还是激素水平的变化，均与PCOS患者接近。但由于介入外源性的雄激素，为排除外源性雄激素造成的干扰，故造模时同时采用芳香化酶抑制剂。芳香化酶抑制剂所造肾虚痰湿特征信息PCOS大鼠模型与人类疾病相似，可作为DHEA造模的对比。本研究加用高脂乳剂造模大鼠模拟前述近似肾虚痰湿证型患者的多项特征生化信息，此改良造模方法在课题组前期研究中已有论述［8］。Letrozole肥胖模型组大鼠的体质量增加幅度高于Letrozole模型组，TC及TG极显著高于空白对照组、高脂模型组和Letrozole模型组。DHEA肥胖模型组大鼠的TC及TG极显著高于空白对照组、高脂模型组和DHEA模型组。大鼠处死时体质量增加幅度明显升高，血脂TC、TG增高，成功建立肥胖PCOS模型。PCOS的病理特点为卵泡发育过程中卵泡募集亢进，优势化选择受阻和卵泡闭锁退化失调，造成小卵泡的集聚，无优势卵泡形成。卵母细胞和卵泡发生是一个协同过程，卵母细胞的生长和卵泡发育与卵母细胞和体细胞的相互交流有着重要的联系。研究表明，卵母细胞分泌的GDF-9和BMPR-2对调节卵巢功能、卵泡发育过程中卵泡膜细胞增殖与分化具有重要作用，推测GDF-9参与了肥胖PCOS发病的病理生理过程。由卵子分泌的GDF-9和BMPR-2可直接调节颗粒细胞的增生、分化、代谢、黄素化和凋亡，颗粒细胞的分泌信号也通过颗粒细胞间的缝隙连接调节卵子的生长和发育［9-10］。

本研究结果表明，Letrozole模型组、Letrozole肥胖模型组、DHEA模型组和DHEA肥胖模型组GDF-9表达降低，可以推测GDF-9在肾虚痰湿特征信息PCOS大鼠模型的卵巢卵泡颗粒细胞中表达的降低，可能是影响卵母细胞形成及质量的原因之一，而卵巢发育的异常又会影响GDF-9的分泌，从而形成恶性循环。Letrozole模型组、Letrozole肥胖模型组、DHEA模型组和DHEA肥胖模型组BMPR-2平均灰度均值均低于空白对照组。BMPR-2表达水平的降低也可能是影响卵母细胞形成及质量的原因之一，GDF-9与BMPR-2结合才能发挥作用，BMPR-2表达的降低将进一步导致GDF-9信号通路异常，从而影响卵母细胞的形成及质量。有临床研究也显示，PCOS不排卵患者GDF-9 mRNA的表达降低并延迟［11］。

综上所述，具有近似中医临床肾虚痰湿证型特征信息的肥胖PCOS动物模型颗粒细胞中GDF-9、BMP-2蛋白表达水平低下可能影响卵母细胞质量，形成大量的闭锁卵泡和囊状卵泡，无排卵前的成熟卵泡，最终导致肥胖PCOS形成。因此对GDF-9和BMPR-2的深入研究，对治疗肾虚痰湿证肥胖型PCOS具有临床指导意义，二者之间的相互作用尚有待进一步的研究。

［1］Legro RS，Spielman R，Urbanek M，et al.Phenotype and genotype in polycystic ovary syndrome［J］.Recent Prog Horm Res，1998，53:217-256.

［2］李琴华，吴效科，侯丽辉.肥胖与多囊卵巢综合征相关性的研究进展［J］.世界中西医结合杂志，2008，3(3):117.

［3］Otsuka F，McTavish KJ，Shimasaki S.Integral role of GDF-9 and BMP-15 in ovarian function［J］.Molecular Reproduction and Development，2011，78(1):9-21.

［4］Zhao SY，Qiao J，Chen YJ，et al.Expression of growth differentiation factor-9 and bone morphogenetic protein-15 in oocytes and cumulus granulosa cells of patients with polycystic ovary syndrome［J］.Fertility and Sterility，2010，94(1):261-267.

［5］Vitt UA，Mazerbourg S，K lein C，et al.Bone morphogenetic protein receptor type II is a receptor for growth differentiation factor-9［J］.Biol Reprod，2002，67:473-480.

［6］Otsuka F，McTavish K J，Shimasaki S.Integral role of GDF-9 and BMP-15 in ovarian function［J］.Mol Reprod Dev，2011，78 (1):9-21.

［7］Paulini F，Melo E O.The role of oocyte-secreted factors GDF9 and BMP15 in follicular development and oogenesis［J］.Reprod Domest Anim，2011，46(2):354-361.

［8］姚莉娟，徐晓娟，王婧婧，等.体现中医病因病机的多囊卵巢综合征动物模型评价及筛选［J］.世界科学技术:中医药现代化，2014，16(10):2137-2148.

［9］Nandedkar T，Dharma S，Kodi D，et al.Differential gene expression in transition of primordial to preantral follicles in mouse ovary［J］.Soc Reprod Fertil Suppl，2007，63:57-67.

［10］Gilchrist RB，Lane M，Thompson JG.Oocyte-secreted factors: regulators of cumulus cell function and oocyte quality［J］.Hum Reprod Update，2008，14(2):159-177.

［11］Albertini DF，Barrett SL.Oocyte-somatic cell communication［J］.Reprod Suppl，2003，61:49-54.

Expression Research on GDF-9，BMPR-2 in the PCOS Rat Models Simulate the Feature Information of Kidney Deficiency and Phlegm-dampness Stagnation

DENG Di-si，XU Xiao-juan△，YAO Li-juan，WANG Zhang，HUANG Li-hua，LI Wang-jing，HE Yun-liang
(Chengdu University of Chinese Medicine，Chengdu 610075，China)

Objective: To study the expression of Growth differentiation factor 9 (GDF-9) and Bone morphogenetic protein receptor type 2 (BMPR-2) in the ovarian granular cells of the obese Polycystic Ovary Syndrome(PCOS) rat models which has the characteristics of the deficiency of kidney and the stagnation of phlegm-dampness．Method: The obesity PCOS rat models were built respectively with high fat emulsion on the basis of Letrozole and DHEA(Dehydroepiandrosterone) models．The models were verified by the smears of vaginal exfoliated cells，the weight growth rate when rats were killed，the lipid levels and the morphological changes of ovarian．Immunohistochemical method was chosen to detect the expression of GDF-2，BMPR-2 in the ovarian tissue granulosa cells of rat models．Results: Models were set up successfully．The GDP-9 integral optical density in Letrozole group and Letrozole obese group were both significantly lower than high fat emulsion group．Besides，the GDP-9 average grayscale valuein Letrozole obese group was lower than high fat emulsion group; the GDP-9 integral optical density in DHEA group and DHEA obese group were significantly higher than the blank control group; the BMPR-2 integral optical density in Letrozole group was significantly higher than high fat emulsion group; the BMPR-2integral optical density in DHEA group was significantly higher than high fat emulsion group，the differences were statistically significant．Conclusion: It can be inferred that the expression of GDF-9 and BMPR-2 reduced in the ovarian follicle granulosa cells of the obese PCOS rat models were likely to be the important reasons for occurrence and development of the obese PCOS．

GDF-9;BMPR-2;Characteristics Of the Deficiency of Kidney And the Stagnation Of Phlegm-dampness; the Obese PCOS Rat Model;Granular Cells

R285.5

:B

:1006-3250(2016)05-0621-05

2015-09-14

国家自然科学基金资助项目(81470199)-经APN信号通路探讨补肾化痰法调控肥胖型PCOS卵泡发育机制研究;成都中医药大学科技发展基金项目(ZRMS201307)-PCOS动物模型中肾虚痰湿型诊断要素的信息挖掘研究

邓蒂斯(1990-)，女，四川成都人，在读硕士，从事中药对女性生殖内分泌调控的临床与研究。

△通讯作者:徐晓娟(1969-)，女，江苏镇江人，副研究员，医学博士，硕士研究生导师，从事补肾中药对女性生殖内分泌调控的临床与研究，Tel:13980971928，E-mail:847956379@ qq.com。