益气养阴活血方对糖尿病肾病大鼠肾组织WT1影响的实验研究❋

宋纯东，张霞△，宋丹丹，薛黎明，任瑞英，杨晓丽，侯小静

(1.河南中医学院第一附属医院，郑州450008;2.郑州市第三人民医院，郑州450000; 3.河南中医学院第三附属医院，郑州450003;4.郑州市儿童医院，郑州450005; 5.河南郑州市金水区人民医院，郑州450000;6.郑州市中医院，郑州450000)

益气养阴活血方对糖尿病肾病大鼠肾组织WT1影响的实验研究❋

宋纯东1，张霞1△，宋丹丹2，薛黎明3，任瑞英4，杨晓丽5，侯小静6

(1.河南中医学院第一附属医院，郑州450008;2.郑州市第三人民医院，郑州450000; 3.河南中医学院第三附属医院，郑州450003;4.郑州市儿童医院，郑州450005; 5.河南郑州市金水区人民医院，郑州450000;6.郑州市中医院，郑州450000)

目的:探讨益气养阴活血方对糖尿病肾病(DN)大鼠肾组织WT1表达的影响。方法:大鼠喂养1周后按随机数字表法分为空白组、模型组、中药组并建立DN大鼠模型。造模成功后空白组和模型组灌服生理盐水，中药组灌服益气养阴活血方颗粒剂，8周后生化检测24 h尿蛋白、血肌酐(Scr)、谷丙转氨酶(ALT)等;测量肾小球直径，称取左肾质量、计算肥大指数;PAS染色观察大鼠肾脏病理;免疫组化检测肾组织WT1表达。结果:益气养阴活血方能够上调实验大鼠肾组织WT1的表达，减少24 h尿蛋白、Scr及BUN水平，升高ALB，缩小肾小球直径，改善肾脏病理。结论:益气养阴活血方可能通过影响DN大鼠肾组织WT1的表达而改善上述生化指标，减轻肾脏病理损害，对肝功能未见明显损害。

糖尿病肾病;益气养阴活血方;WT1;实验研究

糖尿病肾病(diabetic nephropathy，DN)是糖尿病的主要并发症之一，尿蛋白是DN发生发展的主要危险因素，足细胞是DN蛋白尿的形成和发展的重要参与者，早期糖尿病肾脏足细胞数量即可减少［1］。肾母细胞肿瘤1(WT1)是足细胞分化的转录因子，WT1-C末端多克隆抗体(WT1-C)表达在足细胞的细胞核，可作为足细胞的标记蛋白［2-4］，提示DN发生时肾脏足细胞WT1的表达减少。前期临床研究发现，“益气养阴活血方”有降低蛋白尿的作用［5］。动物实验发现，该方可能通过影响TGF-β1/ p38MAPK［6］、Smad2［7］、JAK2/STAT3［8］等通路而改善DN模型大鼠肾脏病理。本研究旨在观察本方对DN大鼠肾脏足细胞WT1表达的影响与降低蛋白尿、改善肾脏病理的相关性，为临床应用进一步提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 主要药物

益气养阴活血方颗粒由生黄芪、生地、菟丝子、积雪草、炙大黄、水蛭组成，药材由四川新绿色药业科技有限公司提供并加工为颗粒剂。

1.2 试剂

兔抗大鼠WT1一抗购于Sant Cruz公司;生物素标记山羊抗兔IgG及DAB显色剂购于中杉金桥生物有限公司。

1.3 造模及分组

清洁级雄性SD大鼠36只，体质量(200±20) g，由河南省实验动物中心提供(许可证号SCXK (豫)2010-0002)。按随机数字表法分为空白组、模型组、中药组3组，适应性喂养1周后模型组和中药组应用链脲佐菌素(streptozotocin，STZ)45 mg/kg单次腹腔注射，空白组给予同等剂量新鲜配制的柠檬酸钠缓冲液腹腔注射，3 d后连续监测血糖，血糖≥16.7 mmol/L，尿糖阳性，尿蛋白阳性，尿量大于正常组150%者为造模成功。

1.4 给药方法及剂量

空白组和模型组灌服生理盐水(1 ml/100 g)，中药剂量按照成人用药剂量(按体质量60 kg计算)的12.5倍(22.30 g/kg)，共给药6周。

1.5 观察指标

1.5.1 生化指标检测灌胃第6周末禁食不禁水，代谢笼留取24 h尿液，双缩脲法测定24 h尿蛋白定量;于第2天麻醉后股动脉取血2 ml，AU800全自动生化分析仪检测ALT、ALB、BUN、Scr和血糖。

1.5.2 肾脏病理检测处死大鼠，切取左侧肾脏去除被膜迅速称量;取右肾少量组织常规制片，PAS染色，光镜下放大400倍观察肾脏病理，测量肾小球直径、肾小管短径距离来判断肾小球肥大程度和肾小管的肿胀程度。测量方法:光镜下浅层皮质区随机取10个肾小球，用图像分析系统测量肾小球直径并取平均值;避开肾小球和细小动脉随机取10个肾小管视野，计算完整肾小管数目，用图像分析系统测量每个完整肾小管的短径距离，取平均值。

1.5.3 免疫组化(IHC)检测按试剂盒操作说明检测肾组织WT1的表达。

1.6 统计学方法

采用SPSS Version 19.0 for W indows进行统计分析，以均数±标准差(±s)表示，组间比较采用单因素方差分析，P＜0.05，P＜0.01为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 生化指标

表1显示，ALB:中药组较模型组升高(P＜0.01);ALT、BUN、Scr:3组比较差异无统计学意义(P＞0.05);24 h尿蛋白定量:中药组较模型组降低(P＜0.01);空白组与中药组比较差异无统计学意义(P＞0.05)。

表1 大鼠肝、肾功能、尿蛋白的变化(±s)

表1 大鼠肝、肾功能、尿蛋白的变化(±s)

注:与空白组比较:＊＊P＜0.01;与模型组比较:ΔΔP＜0.01

组别鼠数ALB(g/L)ALT(U/L)Scr(umol/L)BUN(mmol/L)24 h尿蛋白(g/24 h)空白组11 24.10±1.75 87.36±16.43 41.79±4.80 8.87±0.97 0.0371±0.0166模型组10 16.99±0.69＊＊105.10±29.24 43.91±10.81 10.24±1.88 0.1818±0.0372＊＊中药组8 21.80±1.16ΔΔ85.00±30.93 39.46±3.98 8.28±2.66 0.0553±0.0075ΔΔ

2.2 肾脏外观及病理

图1显示，空白组肉眼看肾脏大小、症状正常，色暗红，表面光滑，包膜易剥离且无黏连。光镜下肾小球结构清晰、完整，未见肥大，肾小球毛细血管基底膜、系膜及其基质未见异常改变。模型组肉眼看肾脏体积增大，光镜下可见肾小球弥漫性肥大，肾小球毛细血管基底膜弥漫增厚、僵直，系膜区增宽，系膜细胞增生，系膜基质增多，部分足细胞、壁层上皮细胞肥大而少数脱落。中药组病理改变程度相对较轻。

图1 PAS染色法观察肾小球体积、肾脏病理(×400)

2.3 大鼠肾组织WT1蛋白的表达

图2表2显示，WT1在肾小球脏层上皮细胞表达，肾小管内无表达。免疫组化结果显示，与空白组比较，模型组WT1表达减少(P＜0.01)，与模型组比较，中药组增多(P＜0.01)。

图2 免疫组化法检测W T1在肾小球脏层上皮细胞表达(×400)

表2 各组大鼠肾小球体积与肾组织中W T1蛋白表达的比较(±s)

表2 各组大鼠肾小球体积与肾组织中W T1蛋白表达的比较(±s)

注:与空白组比较:＊＊P＜0.01;与模型组比较:ΔΔP＜0.01

组别鼠数肾小球体积WT1蛋白表达空白组11 101.58±9.91 15.81±1.21模型组10 186.93±16.19＊＊8.14±0.87＊＊中药组8 132.86±7.32ΔΔ13.46±0.92ΔΔ

3 讨论

DN的主要病理特征是肾小球细胞外基质堆积、系膜增宽、基底膜增厚、肾小球硬化及肾间质纤维化，然而这些因素仅能解释30%～50%的尿蛋白排泄率和肾小球滤过率的变化［2］。研究表明，WT1基因的破坏可导致肾小球硬化的发展［9-10］，蛋白的形成也受WT1基因的调节［11］，因此DN蛋白尿与WT1基因的表达密切相关。足细胞是DN蛋白尿形成和发展的重要参与者，当足细胞大量丢失、数目减少时会产生大量蛋白尿。研究发现，在肾小球的3种细胞中，WT1只在足细胞核表达，因而WT1可以作为足细胞胞核的标记。DN出现最早、最明显的肾脏病理变化为肾脏肥大，也是导致肾小球硬化的重要因素。而衡量肾脏肥大的客观指标是肾重/体质量指数，它可以在排除体质量影响的情况下对肾重进行观察。

益肾养阴活血方是依据中医“久病必虚”“久病必瘀”“久病入络”的理论，以益气养阴、活血化瘀为主要功效，方药由生黄芪、生地黄、菟丝子、积雪草、大黄、水蛭组成，临床观察对早期DN疗效肯定［5］。现代药理研究发现，黄芪有保护肾小管作用;生地有改善肾功能、抗血小板聚集等作用;菟丝子有抗氧化、免疫调节等作用;积雪草提取物具有抑制成纤维细胞增殖的作用;大黄能够减少尿蛋白，改善脂肪、糖、蛋白质代谢的紊乱;水蛭有改善肾脏微循环、防止肾小球硬化、保护肾功能的作用。诸药共奏益肾养阴、活血化瘀之效，寒温并用，补泻兼施，可使肾元得补、瘀浊得除、标本兼顾而诸症自愈。

本研究结果显示，模型组肾重/体质量指数较空白组明显增加，说明造模组大鼠肾脏肥大，符合DN早期的病理变化。中药组肾脏肥大指数明显低于模型组，且ALB明显升高，尿蛋白明显降低，肾组织WT1明显增加，但ALT、Scr、BUN较模型组差异无统计学意义。说明益气养阴活血方可以有效抑制肾脏肥大，改善肾脏病理，减少蛋白尿，升高血浆白蛋白，且对谷丙转氨酶、肾功能无影响。上述结果表明，经中药复方干预治疗后，模型大鼠肾组织WT1蛋白表达与尿蛋白成负性相关，说明中药复方具有保护DN大鼠足细胞的功能，同时可减少蛋白尿、升高ALB、改善肾脏病理等作用，并具有安全性，此可能是益气养阴活血方治疗DN的另一有效机制。

［1］Gross ML，Ritz E，Schoof A，et al.Comparison of renal morphology in the streptozotocin and the SHR/N-cp models of diabetes［J］.Lab Invest，2004，84(4):452-464.

［2］成丽岚，郑少雄.足细胞损伤与糖尿病肾病的研究进展［J］.医学综述，2008，14(3):412-414.

［3］Deen WM，Lazzara MJ，Myers SD:What determines glomerular capillary permeadility J Clin Invest，2004，114:1412-1414.

［4］Cortez P，Riser B，Yee J，et al.Mechanical strain of glomerular mesangial cells in the pathogenesis of glomerulosclerosis:clinical implications［J］.Nephrol Dial Transplant，1999，14:1351-1354.

［5］宋纯东.益肾活血方联合西药治疗早期糖尿病肾病60例［J］.中国中医药现代远程教育，2012，10(1):58-59.

［6］宋纯东，杨晓丽，薛黎明，等.益肾活血方对早期糖尿病肾病大鼠肾组织TGF-β/p38MAPK信号传导的影响［J］.广州中医药大学学报，2012，29(6):674-679.

［7］宋纯东，薛黎明.益肾活血方对早期糖尿病肾病大鼠肾组织Smad2的影响［J］.中国中医基础医学杂志，2011，17(11): 1027-1029.

［8］宋纯东，任瑞英，薛黎明，等.益肾活血方对早期糖尿病肾病大鼠肾组织JAK2/STAT3的影响［J］.中国中医基础医学杂志，2012，18(8):847-851.

［9］Patek CE，Little MH，Flemming S，et al.A zinc finger truncation of murine wt1 results in the characteristic urogenital abnormalities of Denys-Drash syndrome［J］.Proc Natl Acad Sci USA，1999，96:2931-2936.

［10］Hammes A，Guo JK，Lutsch G，et al.Two splice variants of the Wilms’tumor 1 gene have distinct functions during sex determination and nephron formation［J］.Cell，2001，106:319-329.

［11］Guo J，Menke AL，Gubler M-C，et al.WT1 is a key regulator of podocyte function:reduced expression levels cause crescentic glomerulonephritis and mesangial sclerosis［J］.Hum Mol Genet，2002，11:651-659.

R587.1

:B

:1006-3250(2016)05-0626-02

2015-09-24

河南省中医药管理局中医学科带头人培养专项资助项目(2013ZY0301);河南省科技攻关重点项目(142102310284);河南省中医药科学研究专项课题普通项(2013ZY02065)

宋纯东(1967-)，男，河南民权人，主任医师，教授，医学博士，硕士研究生导师，从事肾小球疾病的中西医诊治机制研究。

△通讯作者:张霞(1978-)，女，浙江景宁人，副主任医师，副教授，医学博士，从事肾小球疾病的中西医临床与研究，E-mail:ardar123@sina.com。