针刺联合医痫丸治疗颅脑外伤癫痫(风痰上扰证)疗效及对NOX2/ROS通路的影响

曹勇，郑慧军

(河南中医学院二附院，郑州450000)

针刺联合医痫丸治疗颅脑外伤癫痫(风痰上扰证)疗效及对NOX2/ROS通路的影响

曹勇，郑慧军

(河南中医学院二附院，郑州450000)

目的:探讨针刺联合医痫丸治疗颅脑外伤癫痫(PTE)风痰上扰证的疗效以及NOX2/ROS通路的影响。方法:选择颅脑外伤癫痫风痰上扰证患者90例，按随机数字表法分为治疗组和对照组各45例;对照组采用苯巴比妥钠肌肉注射200 mg/d，每日2次;或丙戊酸钠片内服，每日按体质量15 mg/kg;癫痫发作时给予氯硝安定内服;治疗组在对照组基础上采用针刺和医痫丸(3 g/次，每日3次)，2组均治疗12周。观察2组癫痫发作持续时间和频次;Western blot法检测2组血清烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶(NOX2)水平;比较2组血清活性氧(ROS)、核因子-κB(NF-κB)、白细胞介素(IL)-1β、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和前列腺素E2(PGE2)水平。结果:治疗组治疗后患者癫痫发作持续时间和癫痫发作频次明显少于对照组，治疗组总有效率88.89%，对照组68.89%，2组比较差异有统计学意义(χ2=4.27);治疗组治疗后患者血清NOX2和ROS水平明显低于对照组;治疗组治疗后血清NF-κB、IL-1β、TNF-α和PGE2均显著低于对照组，2组患者疗程中无严重不良反应。结论:在常规西药基础上，针刺联合医痫丸治疗PTE风痰上扰证控制癫痫发作疗效明显，抑制NOX2/ROS通路从而减缓下游炎症反应可能是其作用机制之一。

医痫丸;针刺;外伤性癫痫;风痰上扰证;氧化应激

颅脑外伤后癫痫(posttraumatic epilepsy，PTE)是症状性癫痫中最常见的类型。调查显示，超过10%的癫痫患者为PTE［1］，在颅脑原发损伤基础上PTE可进一步加重患者脑组织病理损伤以及神经细胞生化改变，恶化病情，增加伤亡风险，对患者的生存健康构成了严重影响［2］。近年来中医药治疗PTE取得较大进展，可增强西药治疗效果，促进疾病痊愈［3］。本研究针对PTE风痰上扰证的病机特点，采取针刺联合医痫丸治疗，收效显著。

医痫丸是临床常用抗癫痫药物，具有祛风化痰、定痫止搐之功。针刺是临床治疗癫痫常用疗法且安全可靠，得到国内外学者一致肯定［4］。研究表明，PTE能够引起机体耗氧量增加，释放大量NO，诱发氧化应激反应，产生大量炎性因子，在癫痫引起的神经细胞损伤中发挥着重要作用［5-6］。因此，在PTE发作期抑制氧化应激反应，从而减少炎性因子的释放及其诱发的炎性损伤具有重要临床意义。本研究旨在观察针刺联合医痫丸治疗PTE的临床疗效以及对氧化应激的影响。

1 资料与方法

1.1 一般资料

表1显示，本组研究选择符合条件病例共90例，均为本院神经内科2012年10月至2014年10月收治因急性中、重度颅脑外伤引起的癫痫病例，经中医辨证为风痰上扰证;所有患者按随机数字表法分为治疗组和对照组各45例，2组患者在性别、年龄、病程、格拉斯哥评分(GCS)以及发作时间上比较差异无统计学意义(P＞0.05)，具有可比性。

表1 2组患者一般资料比较

1.2 诊断标准

1.2.1 癫痫诊断标准参照国际抗癫痫联盟关于癫痫症和癫痫综合征分类标准［7］制定。

1.2.2 风痰火扰神证诊断标准参照《中医内科常见病诊疗指南·西医疾病部分》［8］制定，证候:发则卒然昏仆，目睛上视，口吐白沫，手足抽搐，喉中痰鸣，移时苏醒如常人，病发前多有眩晕，头昏，胸闷乏力，痰多，心情不悦，舌质淡红，苔白腻，脉滑。

1.3 纳入和排除标准

纳入标准:符合以上病证诊断者;年龄18～65岁;有急性中、重型头部外伤史;脑外伤之前无癫痫病史;发作时CT提示有异常脑电图波;入选的患者或患者家属知情并签署知情同意书。排除标准:脑外伤引起严重脑部器质性损伤者;妊娠或哺乳期妇女;对针刺治疗过敏或体质过敏者;合并心脑血管、肝肾以及造血系统等原发性疾病及精神病者;治疗期间不配合用药者。

1.4 治疗方法

1.4.1 对照组采用注射用苯巴比妥钠(上海新亚药业有限公司，国药准字H31020532)肌肉注射200 mg/d，每日2次;或丙戊酸钠片(湖南省湘中制药有限公司，国药准字H43020874)内服，每日按体质量15 mg/kg;癫痫发作时给予氯硝安定(江苏恩华赛德药业有限责任公司，国药准字H32020591)内服，开始时0.5 mg/次，每日3次，每3 d增加0.5 mg，直到发作被控制。

1.4.2 治疗组在对照组用药基础上给予医痫丸联合针刺治疗;医痫丸(北京同仁堂制药有限公司，国药准字Z11020658)3 g/次，每日3次口服;针刺疗法［8］采取泻法，取穴长强、鸠尾、阳陵泉、筋缩、本神、风池、太冲、丰隆、足三里、内关;眩晕者加合谷和百会穴，每日1次，每周5次，2组均连续治疗12周。

1.5 观察指标

1.5.1 观察治疗前后2组癫痫发作频次和持续时间。

1.5.2 2组血清烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶(NOX2)测定采用Western blot法于治疗前后进行测定，常规收集患者血清，经PBS稀释，BCA法测定蛋白浓度，电泳，转膜，5%脱脂牛奶室温封闭1 h，用含一抗NOX2兔抗的5%牛奶稀释(1∶500)4℃过夜孵育，TBST洗膜，5%牛奶稀释的辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG(H+L)(1∶1000)二抗处理2 h，免疫印迹化学发光反应，凝胶成像，β‐actin为实验内参，应用Image J软件进行灰度值分析，NOX2与β‐actin的灰度比值作为NOX2的表达量。

1.5.3 2组血清活性氧(ROS)、核因子-κB (NF-κB)、白细胞介素(IL)-1β、肿瘤坏死因子-α (TNF-α)和前列腺素E2(PGE2)水平采取酶联免疫吸附法(Elisa)于治疗前后检测，试剂盒由上海西唐生物科技有限公司提供。具体方法为:混匀待测样品和试剂，将标准品和待测品滴入微孔中，向待测品的微孔中滴入生物素标记物，每微孔10μL，在加有标准品及待测品的微孔中滴入酶标记物，每微孔50 μL混匀;37℃恒温箱孵育1 h，弃微孔内液体，每个微孔依次滴入50 μL底物Ⅰ和50 μL底物Ⅱ，混匀、避光处理15 min;每孔滴入50 μL终止液，酶标仪测A450值。监测2组疗程中不良反应发生情况。

1.6 疗效评判标准

参照癫痫发作改善［9］标准和《中药新药临床研究指导原则》中医临床症状改善标准制定。临床痊愈:癫痫发作完全控制1年，中医临床症状、体征消失或基本消失，证候积分减少≥95%;显效:发作频率减少＞75%，中医临床症状、体征明显改善，证候积分减少≥70%;有效:发作频率减少50%～75%，中医临床证候、体征均有好转，证候积分减少≥30%;无效:发作频率减少＜50%，中医临床症状、体征无明显改善甚或加重，证候积分减少不足30%。总有效率=基本痊愈率+显效率+有效率。

1.7 统计学方法

采用SPSS 17.0统计软件进行统计分析，计量资料以均数±标准差(±s)表示，组间应用t检验分析，计数资料应用χ2检验处理，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 2组癫痫发作持续时间和频次比较

表2显示，2组患者治疗后癫痫发作持续时间和癫痫发作频次均明显减少(P＜0.01);治疗后治疗组患者癫痫发作持续时间和癫痫发作频次明显少于对照组，差异有统计学意义(P＜0.01)。

表2 2组癫痫发持续时间和作频次比较(±s)

表2 2组癫痫发持续时间和作频次比较(±s)

注:与本组治疗前比较:aP＜0.01;与对照组治疗后比较:bP＜0.01

组别例数时间持续时间/(min/次)频次/(次/月)对照组45治疗前6.52±0.79 4.16±0.57 45治疗后2.24±0.31a1.83±0.21a治疗组45治疗前6.94±0.88 4.33±0.51 45治疗后1.39±0.17ab1.12±0.14ab

2.2 2组治疗后疗效比较

表3显示，治疗组总有效率88.89%，对照组68.89%，2组治疗后疗效比较差异有统计学意义(χ2=4.27，P=0.039＜0.05)。

表3 2组治疗后疗效比较［例(%)］

2.3 2组治疗前后血清NOX2和ROS水平比较

表4显示，2组患者治疗后血清NOX2和ROS水平较治疗前均显著下降(P＜0.01);治疗组患者治疗后血清中NOX2和ROS水平均明显低于对照组，差异有统计学意义(P＜0.01)。

2.4 2组血清NF-κB、IL-1β、TNF-α和PGE2水平比较

表5显示，2组患者治疗后，血清NF-κB、IL-1β、TNF-α和PGE2水平均明显降低(P＜0.01);治疗组治疗后血清NF-κB、IL-1β、TNF-α和PGE2均显著低于对照组，差异有统计学意义(P＜0.01)。

表4 2组治疗前后血清NOX2和ROS水平比较(±s)

表4 2组治疗前后血清NOX2和ROS水平比较(±s)

注:与治疗前比较:*P＜0.01;与对照组比较:△P＜0.01

组别例数时间NOX2(灰度值比值)ROS(U/m L)对照组45治疗前0.82±0.09 892.86±90.49 45治疗后0.59±0.07*751.36±76.43*治疗组45治疗前0.85±0.11 894.17±90.84 45治疗后0.34±0.05＊△586.73±59.56＊△

表5 2组血清NF-κB、IL-1β、TNF-α和PGE2水平比较(±s)

表5 2组血清NF-κB、IL-1β、TNF-α和PGE2水平比较(±s)

注:与治疗前比较:*P＜0.01;与对照组比较:△P＜0.01

组别例数时间NF-κB/ng·m L－1IL-1β/pg·m L－1TNF-α/ng·L－1PGE2/ng·L－1对照组45治疗前24.15±2.61 17.82±1.90 31.02±3.25 143.51±14.77 45治疗后21.46±2.23*15.48±1.68*23.58±2.62*122.83±12.64*治疗组45治疗前24.39±2.78 17.69±1.75 30.76±3.11 141.89±14.42 45治疗后19.32±12.03＊△12.35±1.46＊△17.32±1.93＊△103.46±10.37＊△

2.5 2组不良反应情况

对照组中1例出现恶心、腹泻，2例轻度头晕、困倦，1例轻度皮疹反应;治疗组中2例消化不良，1例头晕、困倦，2例皮肤过敏。以上不良反应经对症处理或停药后症状均消失，所有患者治疗后血常规、肝肾功能检查均无异常。

3 讨论

PTE属于中医学“痫证”“羊角风”等范畴。《本草纲目》曰:“脑为元神之府”，其病位在肝，但与心、脾、肾等紧密相关。癫痫的证候因素研究发现，癫痫病实证以痰凝、风淫、火热和血瘀为主，虚证以气虚、阴虚和血虚为主;临床对癫痫辨证治疗时要注意痰凝、风淫、火热和血瘀等因素，同时兼顾气、阴和血的不足［10］。《医学纲目·癫痫》记载:“癫痫者，痰邪逆上也”，提出“治痰为主”的法则。此外，颅脑外伤性损害可直接引起脑挫裂伤、脑出血，因此在整个PTE治疗过程中，活血化瘀治疗是重要的环节之一［11］。

本研究中医痫丸由生白附子、天南星、半夏、猪牙皂、僵蚕、乌梢蛇、蜈蚣、全蝎、白矾、雄黄、朱砂组成，功用祛风化痰、定痫止搐，是临床用于癫痫发作时治疗的中成药。《针灸甲乙经》提出:“治之，补其不足，泻其有余，调其虚实，以通其道，而去其邪。”因此，笔者对PTE风痰上扰证进行针刺治疗中主要以泻法为主，方中鸠尾为任脉络穴，可激发督脉经气、振奋阳气、升清降浊，达到豁痰开窍的作用;长强为督脉起始穴，具有祛风和调整一身阴阳之功;风池穴是为阳维脉、阳跷脉与手足少阳经脉之交会穴，升发阳经之气，使髓海得养则神识渐清。研究发现，针刺风池能解除颈项痉挛，消除炎症，促进血液回流入脑［12］。风池属足少阳胆经，肝与胆相表里，故能疏肝利胆，使风阳不起而泄肝火、清利头目［12］。筋缩是治疗癫痛之要穴，主治脊强、痉挛等症;本神为足少阳胆经之腧穴，针刺可吸湿降浊、宁神开窍;太冲穴是肝经原穴，能补益肝肾，旨在滋水涵木、平肝息风;足三里为胃经下合穴，丰隆是足阳明胃经络穴，两穴合用健脾化湿、祛痰化浊;内关为手厥阴心包经络穴，可安神定志、镇惊开窍，诸穴合用化痰开窍、平肝息风，兼可活血化瘀。

本研究结果显示，在西药治疗基础上用针刺联合医痫丸治疗可明显减少癫痫发作持续时间及发作频次。治疗36周后疗效分析发现，针刺联合医痫丸治疗患者的总有效率88.89%，明显优于对照组68.89%，差异有统计学意义(χ2=4.27，P＜0.05)。以上结果均提示，PTE风痰上扰证采用针刺联合医痫丸治疗值得临床推广。

PTE患者颅脑损伤常致颅内压升高，诱发局部脑组织缺血、缺氧反应，引起氧化应激反应，使大脑皮质神经元异常放电诱发癫痫发作［13］;NOX2为多个亚单位构成的酶复合体，具有氧化活性，是机体产生ROS的主要途径之一。研究显示，机体NOX2的含量与神经元的增殖、凋亡等联系密切。NOX2表达异常或过表达可通过刺激ROS异常升高而引起神经细胞氧化损伤［14］。本研究结果显示，针刺联合医痫丸治疗后患者血清中NOX2和ROS水平均明显降低，且低于单纯西药治疗，差异有统计学意义。提示针刺联合医痫丸对PTE风痰上扰证的临床治疗效果可能与其抗氧化应激作用相关。

研究发现，机体NOX2受刺激表达升高后，其与细胞色素b558结合形成复合酶，释放超氧阴离子，后者进入细胞内产生ROS，ROS可激活NF-κB，然后通过多条信号传导途径诱导大量神经免疫炎性因子释放，如TNF-α、PGE2和IL-1β等［15］，这些炎性因子可加剧脑内炎性反应，不断损伤神经细胞，加重PTE发病过程［16］。为进一步验证并探讨本作用的可能机制，本研究观察了针刺联合医痫丸治疗对NOX2-ROS通路下游相关炎性因子的变化。结果显示，针刺联合医痫丸治疗患者血清NF-κB、IL-1β、TNF-α和PGE2均显著降低且低于对照组，差异均有统计学意义。以上结果均提示，针刺联合医痫丸治疗可能通过抑制NOX2/ROS通路，从而减缓下游炎性因子反应造成的损害达到治疗效果。上述均为正向治疗研究结果，对NOX2/ROS通路进行拮抗或激动，对本研究结果是否能达到预期效果，在组织学和形态学等方面结果是否一致，均有待于进一步的动物实验证实。

综上所述，在西医用药基础上，针刺联合医痫丸治疗PTE风痰上扰证疗效明显，其作用机制可能与其降低NOX2和ROS水平，通过抑制NOX2/ROS通路从而降低氧化应激对神经细胞产生的损伤。本研究选择病例均为本院患者，纳入的病例量相对较小，对结果可能产生一定的偏倚，因此确切结论有待于进一步的多中心、大样本量研究证实。

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Effect of Acupuncture Combined with Medicine in Treatment of Posttraumatic Epilepsy with Syndrome of Wind-phlegm Invading Upward on NOX2 /ROS Pathway and Efficacy Research

CAO Yong，ZHENG Hui-jun
(The Second affiliated hospital of Henan Chinese Medicine college，Henan Zhengzhou，450000，China)

Objective: To discuss effect and possible mechanism of acupuncture combined with medicine in treatment of posttraumatic epilepsy (PTE) with syndrome of wind-phlegm invading upward and influence on NOX2 /ROS pathway．Method: Ninty patients of posttraumatic epilepsy with syndrome of wind-phlegm invading upward were selected and randomly divided into treatment group and control group of 45 cases each by randomized digital table．Patients in control group were injected with phenobarbital sodium muscle injection (200 mg / d，bid) or taken valproate orally (15 mg / kg，per day) ．Clonazepam was given for oral administration when epileptic seizure．On the basis of control group，patients in treatment one received therapy of acupuncture combined with Yixian pills orally(3 g / time，tid) ．Courses of treatment for two groups were 12 weeks．Epileptic seizure frequency and time of duration were observed in two groups．Serumlevels of adenine dinucleotide phosphate oxidase(NOX2) were detected by Western blotting method．Serumlevels of reactive oxygen species(ROS) ，nuclear factor-κB(NF-κB) ，interleukin(IL) -1β，tumor necrosis factor-α(TNF-α) and prostaglandin E2 (PGE2)were compared．Results: Epileptic seizure frequency and time of duration in treatment group were significantly lower than control group after treatment respectively．The total effective rate for treatment group was 88. 89% ，better than control group with 68. 89% with significant differences(χ2= 4. 27) ．Serumlevels of NOX2 and ROS in treatment group were obviously lower than control one after treatment．Serumlevels of NF-κB，IL-1β，TNF-α and PGE2 in treatment group were obviously lower than control group after treatment．No serious adverse reaction was in both groups during treatment．Conclusion: Based on routine western medicine，acupuncture combined with medicine in treatment of PTE with syndrome of wind-phlegm invading upward brought about a striking effect on controlling epileptic attack．Inhibiting NOX2 /ROS pathway and slowing downstream inflammatory response maybe one of the mechanisms．

Yixian pills;acupuncture;posttraumatic epilepsy;syndrome of wind-phlegm invading upward;oxidative stress

R247

:B

:1006-3250(2016)05-0674-04

2015-11-09

曹勇(1975-)，男，主治医师，医学硕士，从事神经外科的临床与研究。