冠心病血瘀证的基因网络模块研究❋

袁野，申春悌，胡镜清

(1.南京中医药大学，南京210023;2.南京中医药大学附属常州医院，江苏常州213000; 3.中国中医科学院中医基础理论研究所，北京100700)

冠心病血瘀证的基因网络模块研究❋

袁野1，申春悌2△，胡镜清3

(1.南京中医药大学，南京210023;2.南京中医药大学附属常州医院，江苏常州213000; 3.中国中医科学院中医基础理论研究所，北京100700)

目的:探讨冠心病血瘀证基因网络中重要模块的生物学功能与通路。方法:搜索文献中冠心病血瘀证相关基因，并运用CYTOSCAPE进行网络构建，MCODE进行模块划分后再对重要模块进行功能与通路分析。结果:冠心病血瘀证网络中BCL2、VEGFA、IL-6、JUN和IL-8具有重要作用。血管平滑肌增殖和toll样受体信号通路分别是网络中最重要的生物学过程与通路。结论:该研究既体现了冠心病血瘀证基因的整体特点，又关注了基因网络的局部差异，为冠心病的预防与治疗提供了新的思路。

冠心病;血瘀证;网络;模块

冠状动脉粥样硬化性心脏病简称冠心病，现代研究表明，本病的发生与血液黏度增高、血小板聚集增强致微循环障碍相关［1］。有研究证实，本病以活血化瘀药治疗具有较好的临床疗效［2-3］。冠心病中医文献中，血瘀证是其最常见的证型［4］。

目前已有较多对本病血瘀证的研究，如殷惠军等研究发现，冠心病血瘀证差异基因IL-8具有激活血小板的作用［5］。毛以林等探讨了ACE基因插入/缺失(insertion/deletion，I/D)多态性与冠心病血瘀证的关系［6］。这些研究关注了冠心病血瘀证患者单个或多个基因表达的上调或下降，探讨了基因在疾病中的相关作用机制。但疾病的发生是整体的紊乱，是多个基因参与的多靶点、多通路的改变。2007年《新英格兰医学杂志》报道了与冠心病密切相关的几个基因位点，在这几个基因位点单独或者联合作用下，冠心病发病风险大为增加［7］。如何从诸多基因之间探索它们的联系，网络构建为我们提供了可行的方法。本研究在之前学者研究方法的基础上，通过对文献中冠心病血瘀证相关基因的分析及建模，进一步探索网络中局部基因之间的联系，力图从现代科学的角度进一步挖掘证的实质。

1 文献来源

1.1 文献检索方法

以“冠心病”、“血瘀证”、“基因”为关键词，检索CNKI、CBM、维普、万方等中文数据库，包含期刊和硕博论文。

1.2 纳入和排除标准

1.2.1 纳入标准有明确的疾病和血瘀证诊断标准。

1.2.2 排除标准重复发表或数据不完整的文献;会议摘要和评论及不能获得完整数据的文献。

2 研究方法

2.1 基因网络分析

基因的网络构建采用Agilent Literature Search。一款搜索文献中与研究相关基因的软件，并在搜索结果的基础上构建相互联系的网络。通过Cytoscap插件可生成网络概括图。

2.2 模块划分

在构建冠心病相关网络后，运用MCODE插件对网络进行模块划分，以发现局部网络中重要性及联系更为密切的基因。MCODE最初是用来检测PPI网络中的蛋白质复合物的一种聚类算法，能够在大规模的蛋白相互作用网络里检测出紧密连接的区域(即分子复合物)。现在该方法也可用于在其他类型的网络中检测出聚类，如基因的聚类［8］。

2.3 功能富集与通路查询

在划分模块之后，本研究又对前三重要模块的重叠基因进行了功能分析，采用DAVID 6.7(http:∥david.abcc.ncifcrf.gov/)软件对各组的模块进行GO功能注释和KEGG通路查询。

3 结果

将119个基因导入Agilent Literature Search后，与冠心病血瘀证关系密切的另外493个基因被挖掘出，总共612个节点1834条边构成了冠心病血瘀证的整体基因网络。其中每个节点代表1个基因，边的存在表明基因与基因之间具有关联性。

将整体网络分用MCODE进行模块划分，共有51个模块，模块的重要性根据模块性(由节点数、边数及介数中心性决定)排列，其中模块1与模块2的重要性明显高于其他模块。

模块1共30个基因156条边，BCL2、JUN、IL-6和VEGFA是拥有边最多的基因(图1)。模块2共15个基因81条边，IL-8、TNFA、MMP12是拥有边最多的基因(图2)。

表1显示，对最重要的2个模块进行富集分析与通路查询，发现模块1共有224个GO功能，10条KEGG通路;模块2共有98个GO功能，4条KEGG通路。

表1 模块1与模块2中最有意义的生物学过程及通路。

图1 M CODE最重要的模块1

图2 M CODE第二重要的模块2

4 讨论

网络中的边代表基因之间存在联系，边越多则联系越广泛，基因的重要性越强。MCODE模块1中边最多的4个基因是BCL2、VEGFA、IL-6和JUN，那么可以认为这4个基因在模块1中对其生物学功能及通路具有重要影响。通过功能富集发现，模块1最重要的生物学功能与通路分别是血管平滑肌增殖和toll样受体信号通路。

之前Nair等研究了冠心病炎症因子层面的整体关联，从整体网络中找到了重要的节点及生物学过程。发现白介素6(IL-6)、血管内皮生长因子A (VEGFA)、白介素1β(IL-1β)、肿瘤坏死因子(TNF)和前列腺素过氧化物合成酶2(PTGS2)是网络的中心节点，其中白介素6具有最大的度及最高的介数中心性，JUN是最重要的调控网络的转录因子。Smooth muscle cell proliferation(血管平滑肌增殖)，acute-phase response(急性阶段反应)，calcidiol 1-monooxygenase activity(单氧化酶活性)是最重要的3个生物学过程。toll-like receptor signaling pathway(toll样受体信号通路)，NOD-like receptor signaling pathway(NOD样受体信号通路) and regulation of phosphorylation(调控磷酸化)是最重要的信号通路［9］。

本研究结果显示，VEGFA、IL-6和JUN基因，血管平滑肌增殖过程及toll样受体信号通路、NOD样受体信号通路同样参与了冠心病血瘀证的病理过程，表明冠心病血瘀证与其炎症反应存在一定的关系。

本研究显示，血管平滑肌增殖是模块1中最重要的生物学过程。血瘀证的治疗大法以活血化瘀为主。目前已有许多研究表明，活血化瘀药物可以改善冠心病心肌缺血状态下血管平滑肌增殖的过程。刘擎发现，活血化瘀类中药三棱的提取化合物SsnB作为一种新的选择性toll样受体2和toll样受体4拮抗剂，可以减轻动脉粥样硬化的形成与进展中的血管平滑肌细胞的增殖、迁移、炎症反应［10］。研究发现，活血化瘀类中药红花和丹参均具有改善心肌供血、抑制血管平滑肌细胞增殖的药理作用［11-12］。由丹参和红花有效成分制成的丹红注射液通过降低血浆内皮素(ET)水平，抑制血管平滑肌细胞增殖，从而达到抗动脉粥样硬化的作用［13］。

同时4个重要基因也与平滑肌细胞增殖密切相关。Wang等发现，抑制平滑肌细胞的增殖可以提高动脉粥样硬化斑块的稳定性，这与减少炎症因子TNF及IL-6表达相关［14］。Li等认为，CD59表达上调可以预防平滑肌细胞增殖对抗动脉粥样硬化并促进BCL2的表达［15］。赵曙炎等发现，淫羊藿苷可以单独或通过其代谢产物脱水淫羊藿素上调血管形成相关基因VEGFA、MMP-2和IL-8基因的表达，进而促进血管内皮细胞增生［16］。

研究发现，模块1的toll样受体信号通路与冠心病有较大联系。Zhai等发现，toll样受体4在心肌缺血再灌注的大鼠模型中调控炎症反应，并参与逆转心肌重塑的机制［17］。而具有益气活血、化瘀通络的银丹心脑通，通过调控toll样受体信号通路及降低IL-1β、IL-8、d IL-18等炎症因子对抗心肌缺血再灌注的损伤［18］。目前的研究证实，基因BCL2、VEGFA、IL-6、JUN及平滑肌细胞增殖和toll样受体信号通路参与了冠心病的疾病过程，但未有研究表明这些重要基因与该生物学过程、信号通路相互之间同时存在联系。该研究表明，它们在冠心病血瘀证中的作用重要且联系密切。

模块2中边最多的基因是IL8，最重要的生物学过程与通路分别是调控凋亡和NOD2信号通路。Han等发现，甘草查尔酮B在心脏缺血再灌注的过程中具有抗凋亡、抗炎的保护作用，可能与其降低IL-8的表达相关［19］。Stump f等认为，丹参用于冠心病患者时具有抗炎作用，这种作用可能与其显著降低IL8、IL6在血管内皮细胞的表达相关［20］。IL6作为模块1的重要基因同样与模块2的生物学过程相关。同样MMP9也是模块1的组成基因，与模块2的重要通路相关。NOD2信号通路在心肌梗死中具有重要作用，它的减少可以对抗心肌梗死后的心脏重塑，其机制是减少了细胞因子、炎症细胞浸润及降低MMP9活性［21］。

IL6与IL8均为各自模块的重要基因，但IL6所在模块为冠心病中最重要的模块，因此IL6在冠心病血瘀证中的作用更为关键。

随着后基因组学时代的到来，与疾病相关的基因研究迅速涌现，因此从海量的文献中挖掘出信息的关联性也变得愈加复杂。网络分析的方法帮助研究者对之前的研究进行了整体性回顾与串联。值得肯定的是，该研究方法既体现了冠心病血瘀证基因的整体特点，又关注了基因网络的局部差异。模块与模块之间并不是孤立的，其构成的基础是在整体网络关联的情况下，内部的联系更为密切。如IL6和IL8它们是各自模块的重要组成基因，具有最多的边，同时又有边联系于其他模块，并与外部模块的通路、基因或功能相关联。

该研究找到了冠心病血瘀证最重要的基因模块及其中的重要基因，若能在此基础上探索有效的同时干预这几个重要靶基因的方药，则可为疾病的诊断与治疗提供新的思路。

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［3］申春悌，徐迪华.论温通逐瘀法［J］.中国医药学报，1994，9(4):43-45.

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Study on Genetic Network Module of Blood Stasis Syndrome of Coronary Heart Disease

YUAN Ye1，SHEN Chun-ti2△，HU Jing-Qing3
(1.Nanjing university of Chinese medicine，Nanjing 210023，China; 2.Changzhou hospital affiliated to Nanjing university of Chinese medicine，Changzhou 213000，China; 3.Basic Theory Institute of Chinese Medicine，CACMS，Beijing 100700，China)

Objective: Blood stasis is the predominant syndrome of coronary heart disease(CHD) ，however，there still lack of a genetic landscape of it．We are aiming to explore the biological processes and pathways of blood stasis of coronary heart disease．Methods: We obtained genes from the literatures and applied Agilent Literature Search for network construction，MCODE for modularized analysis．After that，a functional enrichment analysis was performed to find the biological processes and pathways of the most important modules．Results: 119 Blood stasis-related genes were found from the literatures and were used to mining more potential related genes．Totally，other 489 genes were found correlated to the blood stasis of CHD，612 nodes and 1834 edges consist of the whole network．Each node represents one gene，and edge means there is connection between the genes．Bcl2、VEGFA、IL-6、IL-8 and JUN play important roles in the network for they owning the most edges．Regulation of smooth muscle cell proliferation is the most important biological process of the significant module，toll-like receptor signaling is the most important pathway of it．Conclusion: Our findings are considerably in accord with previous research show that network analysis is an useful and stable tool．It allowed us to gain a better understanding of the pathological mechanism of the blood stasis of CHD．

Coronary Heart Disease;Blood Stasis;Netwok;Module

R541.4

:A

:1006-3250(2016)05-0642-03

2015-11-14

973课题“基于冠心病痰瘀互结证辨证方法的创新研究”(2014CB542903)

袁野(1987-)，男，江苏南京人，医学博士，从事从事中医证候研究。

△通讯作者:申春悌(1949-)，女，江苏常州人，医学学士，博士研究生导师，从事中医证候的临床与研究，Tel: 13906126896，E-mail:czsct@163.com。