液相芯片技术在医学检验诊断中的应用＊

张立营，刘国凤，李克峰

综述与讲座

液相芯片技术在医学检验诊断中的应用＊

张立营，刘国凤，李克峰＊

［摘要］液相芯片技术可以从少量样本中快速得到大量的辅助诊断信息，正逐步从科学研究实验室进入临床实验室，在多种肿瘤标志物联合检测、自身抗体筛查、人类白细胞抗原分型及感染性病原体基因检测等方面具有重要的临床应用价值。现就液相芯片技术在医学检验中的应用做一综述。

［关键词］液相芯片技术平台；医学检验；应用

生物芯片主要包括基因芯片和蛋白芯片两大类，按寻址方式和最终检测载体又可分为固相芯片（flat microarrays）和液相芯片（liguid chip rmicrosphere arrays）。近年来，液相芯片技术（liquid chip technology，LCT）以其独特的优点及临床实用性，正受到越来越多的重视，现就液相芯片的技术原理、特点及其在医学检验方面的临床应用做简要介绍。

1　液相芯片技术的定义

液态芯片是一种全新概念的生物芯片，又称悬浮阵列、流式荧光技术，它是利用标记的微球为反应载体（最常用的标记物为荧光染料），在不同的微球上固定有不同的探针分子（蛋白质或核酸），不同的微球可通过荧光信号或大小进行区分［1，2］。将这些微球混合后悬浮于液相体系中，与待检分子充分反应后，再加入合适的报告分子就构成了液相芯片系统，利用这个系统可以对同一样品中的多个不同的分子同时进行检测。液相芯片技术除了美国Luminex公司开发的系列产品外，还包括在流式细胞仪平台上进行多参数检测的微球芯片技术。目前应用最为广泛的为基于Luminex平台的各种检测应用。目前基于该检测技术平台已研发出数百种检测应用组合，广泛应用于蛋白质、核酸及药物等生物分子的检测［3］。其中临床诊断试剂的开发方面也得到了快速发展，肿瘤标志物、人乳头瘤病毒（human papilloma virus，HPV）分型及自身免疫鉴别诊断等多重分析试剂已通过了美国食品药物管理局（Food and Drug Administration，FDA）或中国食品药品监督管理总局（China Food and Drug Administration，CFDA）认证，显示出广泛的临床应用前景［4，5］。本文主要基于Luminex液相芯片技术展开讨论。

2　Luminex液相芯片技术原理

Luminex液相芯片技术的核心是把微小的聚苯乙烯小球（5.6 μm）用荧光染色的方法进行编码，然后将每种颜色的微球（或称为荧光编码微球）共价交联上针对特定检测物的探针、抗原或抗体。应用时，先把针对不同检测物的编码微球混合，再加入微量待检样本，在悬液中靶分子与微球表面交联的分子进行特异性地结合，在一个反应孔内可以同时完成多达100种不同的生物学反应。最后用LuminexTM分析软件进行分析，仪器通过两束激光分别识别编码微球和检测微球上报告分子的荧光强度。因为分子杂交或免疫反应是在悬浮溶液中进行，检测速度极快，而且可以在一个微量液态反应体系中同时检测多达100个指标［6，7］。

3　Luminex液相芯片技术的发展与现状

Luminex公司成立于1995年，总部位于美国德克萨斯州的奥斯汀，是一家专门致力于研发和生产生物化验分析仪器并将其运用于生命科学领域的公司。1999年第1代基于xMAP（flexible multi analyte profiling，xMAP）技术的Luminex100液相芯片检测系统诞生，可检测100种生物分子，2005年升级推出Luminex 200液相芯片检测系统，于2007年推出了新一代液相芯片检测平台Flexmap 3D，Flexmap 3D更大地提高了检测效率，可以同时对1个样本中的500种不同目的分子进行检测，并且可以一次检测384个不同样本。2010年下半年推出磁珠专用的多重检测系统——Magpix荧光生物反应检测系统。Luminex公司采用类似开发手机应用的方式进行技术推广，即授权不同检测试剂生产厂家发展基于xMAP技术的检测应用组合，包括Bio-Rad、Merck Millipore等行业知名的生物医药公司，推动该技术广泛应用于免疫分析、核酸研究、酶学分析及受体与配体的识别分析等领域中，从而不断扩大Luminex液相芯片技术在基础科学研究和临床检验诊断中的应用［8，9］。截至2014年4月，利用Luminex技术平台进行科学研究试剂研发的公司有24家，另外有34家公司利用此技术进行临床诊断试剂研发，其中也有部分中国的研究机构或诊断试剂生产厂家。目前用于临床检测的项目主要有肿瘤标志物检测、病原体的快速筛查、细胞信号转导相关蛋白检测、激酶活性分析、过敏源筛查、激素和细胞因子检测、基质金属蛋白酶检测及代谢标志物检测等［10，11］。

4　Luminex液相芯片技术在临床检验诊断中的应用

Luminex液相芯片技术的临床应用优势体现在：（1）检测通量高。一次检测可分析多个指标，同时可以批量处理标本。特别适合于需同时检测多个指标进行临床诊断的项目，如常用的多项肿瘤标志物组合综合筛查、自身免疫性疾病多种抗体筛查、TORCH检测、呼吸道病毒多重筛查、HLA-DNA分型等，利用液相芯片技术可同时分析HPV的26种亚型，省去复杂的膜条杂交操作和主观判断的影响。（2）样本用量少。25 μl样本可检测20个以上指标，特别适于较难取材的标本或量少的标本如房水、脑脊液等标本的检测。（3）通用性广。既可以检测蛋白也可以检测核酸。（4）检测速度快且准确性、重复性好。液相芯片多指标联检的速度显著高于常规的酶联免疫吸附试验和化学发光等检测方法，同时由于反应是在液相中进行且每个指标有1000-5000个微球反应单元，依据统计学的原理可以最大限度地减少误差，极大提高了检测的准确性和重复性。（5）灵敏度高且线性范围广。液相芯片检测的灵敏度是常规的ELISA方法灵敏度的10～100倍。检测线性范围可达3.5～5.0个数量级，是常规ELISA检测方法的10倍以上。正是由于Luminex液相芯片技术的多种方法学优势，美国FDA批准将液相芯片技术用于临床检验诊断［12，13］。2001年7月27日，基于Luminex xMAP技术的抗可提取核抗原抗体系列产品率先通过美国FDA的认证。至2014年4月止，美国FDA共批准了60个产品，近1000种指标可应用于临床诊断，是近年来最受关注的临床高通量检测技术。国外液相芯片临床诊断产品取得我国CFDA注册证有HLA分型试剂和自身抗体系列筛查、TORCH、EB病毒（Epstein-Barr virus，EBV）、抗中性粒细胞胞浆抗体和类风湿因子检测试剂。值得一提的是我国诊断试剂厂家也取得Luminex公司授权研发相关临床诊断产品，其中上海一家公司研发并取得CFDA注册证的有15种肿瘤标志物和HPV分型检测试剂，另外广州一家公司通过授权研发了表皮生长因子受体检测试剂。

5　液相芯片技术临床应用存在的问题

虽然液相芯片技术具有传统ELISA、时间分辨免疫荧光或化学发光检测无可比拟的优势，但大规模的临床应用尚有一定的距离［14-16］。其局限性表现在：（1）目前获得CFDA批准用于临床诊断的项目或指标目前还比较少，不能满足临床诊断的需求；（2）开展液相芯片检测项目必须购置昂贵的Luminex液相芯片分析仪，一定程度上也制约了其临床应用；（3）对于蛋白质检测而言，Luminex液相芯片技术不可能达到理论上的检测通量，因为随着检测指标的增多，抗体间的交叉反应及相互干扰明显增加。只有核酸分型才能达到Luminex检测的多重极限；（4）目前尚未建立可靠的液相芯片检测的室内质量控制及室间质量评价的方法以及关于液相芯片检测项目相关的性能验证指标；（5）就液相芯片技术本身而言，目前还没有有效的手段来消除免疫测定中微球的非特异性吸附以及Hook效应。

6　应用展望

液相芯片技术平台为临床诊断中的多重指标分析及批量标本检测提供了自动化的检测手段，正逐步从研究室进入临床实验室，必将会在肿瘤标志物检测、自身抗体检测、HLA分型、HPV基因分型、细胞因子、传染病检测等方面得到极其广泛的应用。可以预见，随着微流体技术、数字信号处理技术、光学信号处理技术及抗体技术研究的不断深入，液相芯片技术在基础研究和临床实验诊断方面将有着广泛的应用前景。

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［2015-08-19收稿，2015-09-17修回］［本文编辑：吴蓉］

Application of liquid chip technology in medical examination

ZHANG Li-ying①，LIU Guo-feng，LI Ke-feng.①The 2nd Sanatorium of Ji＇nan Military Command，Qingdao，Shandong 266071，China

［Abstract］The platform of liquid chip technology can get the diagnosis of a large amount of information from small samples fast，and it has great potential clinical application in the determination of autoimmune antibodies，muhitumor markers，the phenotype of Human Leukocyte Antigen and the genes of infectious pathogens.This article reviews the application of liquid chip technology in medical examination.

［Key words］Liquid chip technology platform；Medical examination；Application

［中图分类号］R319

［文献标志码］A

［基金项目］青岛市公共领域科技支撑计划项目（09-1-1-28-nsh）

［作者单位］266071山东青岛，济南军区青岛第二疗养院检验科（张立营，李克峰）；266034山东青岛，青岛市妇女儿童医院检验科（刘国凤）

［通讯作者］李克峰，Email：lkf808＠163.com

DOI：10.14172/j.issn1671-4008.2016.02.039