自噬在脂多糖炎症模型与胰岛β细胞凋亡中的作用

王霖蕾，姜宏卫，马瑜瑾，王　洁，范梦琳，黄　珂



·综述·

自噬在脂多糖炎症模型与胰岛β细胞凋亡中的作用

王霖蕾1,2，姜宏卫1，马瑜瑾1，王洁1，范梦琳1,2，黄珂1,2

摘要：目的了解自噬在炎症性疾病中的作用研究进展，探索自噬对胰岛β细胞的影响。方法检索国内外已经发表的文献，对脂多糖(LPS)诱导的急慢性炎症模型的自噬及可能机制进行综述，并针对糖尿病胰岛炎症中β细胞的自噬进行探讨。结果LPS可诱导全身系统性炎症反应，且伴随自噬的变化。自噬在维持β细胞数量、结构及功能方面起重要作用。β细胞自噬缺陷是胰岛炎症向糖尿病发展中的一个重要因素。结论自噬在维持炎症平衡和胰岛β细胞凋亡的病理生理过程中起重要作用，自噬失衡可导致多种疾病。通过药物调控自噬，可能是炎症性疾病和糖尿病的新的治疗策略。

关键词：自噬；脂多糖；炎症；糖尿病；胰岛β细胞；凋亡

2.河南科技大学临床医学院，河南洛阳471003

随着人们物质生活水平的提高，营养过剩导致的代谢性疾病发病率急剧增加，如肥胖和2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus,T2DM)等，已成为世界范围内的重大挑战。慢性低度炎症是肥胖和T2DM的特征，常伴有胰岛β细胞功能不同程度的改变[1]。最近的研究表明自噬(autophagy)参与免疫应答和炎症反应的调控[2]。而在多种疾病中，均伴有自噬的改变。自噬是在各种应激时细胞的一种保护机制，它可以降解胞内受损的细胞器和长寿命蛋白，以维持细胞的稳态。本文回顾了自噬与系统性炎症的相关资料，并针对其在胰岛β细胞中的作用进行综述。

1自噬的概念、功能及调控机制

1.1自噬和自噬流的概念自噬，简而言之即“自己吃自己”，细胞可通过自噬，对受损的细胞器和异常的蛋白质等进行分解，并循环再利用[3-4]。自噬流即自噬的流程，是一个动态的过程。最常见的自噬现象为巨自噬，包括6个阶段：起始阶段、囊泡的初始化、延伸、终止、成熟和降解。细胞双层膜包绕有待降解的物质而形成自噬小体，然后融合于溶酶体并降解其内容物[5]。其中，自噬小体膜状结构的产生及底物清除是自噬流的两个密切相关的过程。通常将LC3作为自噬的标记蛋白，并结合自噬底物P62综合评估细胞自噬情况。

1.2自噬的功能及分子机制在细胞的多种生命活动中，自噬均发挥作用，调节细胞存活、维持内环境的稳定状态。主要表现在以下几方面[6-7]：①“求生”机制：饥饿、缺氧、DNA 损伤，当微生物感染时，在自噬作用下，细胞消化部分内容物以提供生命物质，对抗各种应激；②细胞稳态的维持：自噬可调控胞内部分蛋白的表达，并可更新线粒体、内质网等；③参与部分组织的特异性融合过程；④细胞死亡的诱导：自噬在持续性激活状态下，可以作为一种死亡程序，引起细胞死亡。自噬的起始阶段需要两个蛋白酶复合物：①ULK1/2-ATG13-FIP200；②Beclin1-Vps34-Vps15-ATG14。囊泡的形成同时依赖于上述两种复合物[8]，Beclin1与PI3K、Vps34相关，导致PI3K相关蛋白的聚集，如DFCP1、WIPI等。而WIPI可识别PI3K在自噬小体的聚集，且在囊泡延伸复合物ATG12-ATG5-ATG16L1中是必需的[9]。囊泡闭合后其随之与溶酶体结合，囊泡内的内容物即被降解。目前研究最多的自噬通路为mTOR信号通路，主要通过对Ulkl/2的磷酸化，抑制自噬体的形成。其上游调节信号通路为P13K/Akt途径，可激活mTOR通路，导致自噬活性下降。自噬也可通过其他方式诱导，如AMPK、JNK-beclin1等，调控细胞代谢、凋亡、蛋白质分泌及细胞介导的炎症反应。

2自噬与脂多糖炎症模型

2.1LPS诱导的炎症模型脂多糖(lipopoly saccharide,LPS)作为革兰阴性菌菌壁成分，可以启动炎症，导致内毒素血症。长期低剂量LPS干预，可以导致机体出现低度炎症综合征，如肥胖、糖尿病(diabetes mellitus, DM)、非酒精性脂肪肝和慢性炎症性肠病[10-11]。在饮食因素中，如摄入过度的脂肪会引起循环中LPS升高，导致代谢性内毒素血症，故高脂饮食被认为是血液中LPS增高的启动因素[12]。因此，LPS被广泛用于诱导炎症。LPS炎症模型的不同，其给药方式及剂量亦不同。常见的给药方式有腹腔给药、皮下给药、灌胃及静脉注射给药。腹腔注射后，因肠系膜静脉系统吸收面积大、速度快，常用于制备急性LPS炎症模型；LPS通过皮下微血管、淋巴管吸收入血，因皮下血管少，吸收速度慢，可用于制备慢性LPS炎症模型；因灌胃给药存在首过效应，会直接影响入血药量；静脉给药，包括颈静脉及尾静脉注射，药物直接入血，故可用于制备急性LPS炎症模型。文献报道在大鼠尾静脉给药，多采用5 mg·kg-1、7.5 mg·kg-1、10 mg·kg-1、20 mg·kg-1给药[13-16]，腹腔给药剂量从1～10 mg·kg-1不等[17]，并且单次注射构建急性LPS炎症模型。慢性炎症模型的诱导，部分研究者采用5 mg·kg-1或10 mg·kg-1剂量单次腹腔给药，分别给药1个月、3个月、10个月[18-19]；有研究者用LPS 0.5 mg·kg-1，每3天1次，持续3个月[20]；Kitazawa等用LPS 0.5 mg·kg-1腹腔注射，每2周1次，持续6周构建慢性LPS炎症模型[21]。因此，模型不同，给药方式也不同，药物剂量也千差万别。

2.2自噬与LPS炎症模型目前LPS诱导的炎症涉及多个系统，包括神经、消化、呼吸、循环系统等，且伴自噬而变化。研究发现，10 mg·kg-1的LPS腹腔注射24 h后，脑组织中细胞因子IL-1β、IL-6等升高，自噬标志物Beclin1、LC3Ⅱ及p62下降；在3个月的慢性诱导，IL-1β呈中等分泌，Beclin1、LC3Ⅱ下降，而p62增高[20]；用LPS诱导动物急性肾损伤模型中发现肾脏皮质发生自噬，LC3Ⅱ随LPS作用时间和剂量的增加而增加，并且Beclin1也升高[22]。研究表明LPS诱导的自噬对心肌细胞起保护作用，且Toll样受体在此过程中起重要作用[23]。最新的研究提示ATG16L1与克隆氏病易感性相关，并证实其变异体结构的存在，提示细胞自噬与克隆氏病存在密切联系[24-25]。在LPS诱导的急性肝损伤中，发现GFP-LC3荧光斑点的增加，提示有自噬现象的存在，但并未明确自噬在肝损伤中是一种代偿机制还是负向调控[26]；龚清安等在LPS诱导的急性肺损伤模型中发现Beclin-1表达增加，提示自噬能对肺损伤起一定的保护作用[27]。而在硅肺巨噬细胞中，LPS可能通过自噬小体的积累，加剧凋亡的发生[28]。

2.3自噬在LPS炎症模型中的机制自噬对LPS炎症的调控，可能通过以下几个方面：①调控炎症小体：自噬可作为炎症小体的负向调控因子，囊泡延伸复合物中ATG16L1对自噬过程是必需的，其缺失可导致LPS刺激后IL-1β、IL-8的水平更高[29]。相反，自噬激活剂雷帕霉素诱导的自噬可导致IL-1β的降低[30]，自噬可直接包绕并降解炎症小体和IL-1β，间接减少炎症小体形成过程所产生的线粒体DNA、活性氧簇等。②自噬标志物P62可调控氧化应激：自噬除了可清除泛素化蛋白和细菌，在营养敏感通路中P62也参与氧化应激相关基因的上调[31]，尤其是抗氧化转录因子Nrf2调控的基因。正常生理条件下，Nrf2在胞质中与Keap1结合，氧化应激时P62竞争Nrf2结合位点。因此，p62-keap1复合物经自噬途径降解，Nrf2活性增加，启动下游抗氧化蛋白基因的转录，提高细胞抗氧化能力。③炎性介质的分泌：除传统的分泌途径外，也存在“自噬性分泌”炎症介质，其涉及ATG蛋白及自噬过程[32]。据报道哺乳动物的“自噬分泌”有助于促炎因子IL-1β、IL-18的分泌，这个过程有赖于ATG5、自噬小体等的存在[33]。然而，关于炎症与自噬的相互作用机制仍不十分明确，尚需进一步研究。

3自噬、炎症与胰岛β细胞

3.1T2DM胰岛免疫细胞浸润目前研究显示T2DM人群中存在胰岛炎，胰岛周围免疫细胞浸润。Ehses等[34]研究了9个T2DM和7个正常人胰岛中CD68细胞的分布，发现T2DM中胰岛相关巨噬细胞数目更高，另外，CD68浸润与胰岛素活性下降、淀粉样沉积增多有关。Richardson等[35]对15个T2DM和16个正常人胰腺样本进行了CD68、胰岛素染色，对545个DM胰岛和564个正常人胰岛的分析显示DM胰岛中CD68数目是后者的两倍多。Marselli等[36]对DM样本(23±9)个胰岛和对照组(29±13)个胰岛进行研究，发现两者胰岛内平均巨噬细胞数分别为(8.3±8.1)和(3.6±4.3)；此外，在1个DM、2个对照组胰腺样本未显示巨噬细胞浸润。总体来说，糖尿病中胰岛免疫细胞浸润存在各种各样的情况，甚至在同一样本，炎细胞浸润可能发生，也可能不发生。在Ⅰ型糖尿病中，胰岛免疫细胞也存在多样性，胰岛中仅有20%～30%的胰岛素，提示胰岛炎的存在[37]。虽然导致胰岛免疫细胞浸润多样性的因素机制不详，但仍可反应β细胞的功能状态但不影响β细胞的功能检测。

3.2自噬与胰岛β细胞在胰岛β细胞数量和功能的维持方面，自噬具有重要作用。Atg7在自噬小体的形成中是极为重要的，β细胞特异性Atg7基因缺失小鼠出现高血糖、糖耐受不良，血胰岛素水平较对照组偏低，提示在Atg7基因缺失小鼠，胰岛素不足以代偿糖耐受不良。并且，观察到β细胞数量减少、死亡细胞增加、β细胞增殖减少、胰岛素释放减少等现象[38]。最近研究显示β细胞特异性Atg7基因缺失小鼠与ob/ob肥胖小鼠杂交后，发生了严重的糖尿病，提示自噬缺陷的胰岛β细胞可以代偿基础的代谢应激，却无法代偿肥胖所致的代谢应激[39]。因此，β细胞自噬缺陷是肥胖向糖尿病进展中的一个重要因素。Marselli等[36]研究发现ATG3、ATG7、Beclin-1在胰岛内有不同程度的表达，电镜下糖尿病胰腺组织中发现大量死亡的β细胞内可见空泡样改变，不伴随核的改变，提示应为自噬相关的细胞死亡；在分离胰岛组织评估其基因表达，涉及自噬前期阶段的Beclin1与Atg1没有改变，自噬晚期阶段LAMP-2转录下降。这些提示自噬的缺陷/受损与β细胞功能的失调有关。与其他多种器官不同，C57BL/6小鼠过夜禁食后不会诱导β细胞自噬，而胰岛分离后体外饥饿会导致很小的自噬囊泡的积累，其直径<0.5 μm，与C57BL/6小鼠标准饮食喂养结果一致。但在高脂饮食喂养下，可观察到较大的自噬小体积累，直径在0.5～2 μm，即自噬被诱导。持续的暴露于各种各样的应激中，如糖脂毒性、氧化应激等，胰岛β细胞具有高分泌活性[40]，但胰岛β细胞是如何应对各种应激，其中自噬机制及其与其他组织有何不同，仍有待进一步研究。

3.3自噬、炎症与胰岛β细胞在炎症介质中，如细胞因子在糖尿病β细胞死亡过程中起重要作用，导致β细胞凋亡[41]。自噬与凋亡之间存在联系[42]，例如：P62调控蛋白质和细胞器降解，并与几个促凋亡、抗凋亡分子存在相互作用。此外Beclin-1与Bcl-2联系密切，在促凋亡蛋白BH3作用下，由于Beclin-1的释放，自噬即被启动，而Bcl-2、Bcl-XL过表达可抑制自噬。炎性细胞因子暴露引起β细胞凋亡增加，胰岛素分泌指数下降，加入伊马替尼诱导自噬后，β细胞凋亡数目明显减少，并保留胰岛分泌能力，这些提示β细胞凋亡减少与自噬增强有关[36]。因此，推测LPS干预可诱导胰腺炎症，损伤胰岛细胞，其中自噬可能发挥重要作用。

4总结

总之，糖尿病胰岛β细胞存在自噬机制，其在胰岛β细胞凋亡的病理生理过程中起重要作用。而且，自噬在维持炎症平衡方面起重要作用，自噬失衡可导致多种疾病。鉴于胰岛β细胞的特殊性，了解胰岛炎症与自噬间的关系和其机制，有助于寻找新的治疗靶点，保护胰岛β细胞，以预防糖尿病的发生。

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作者单位：1.河南科技大学第一附属医院，河南洛阳471003

The Role of Autophagy in Inflammation Induced by LPS and the Apoptosis of Beta Cell of Pancreatic Islet

WANG Lin-Lei, JIANG Hong-Wei, MA Yu-jin, WANG Jie, FAN Meng-lin, HUANG Ke

(1.First Affiliated Hospital of Henan University of Science and Technology,Luoyang 471003,China;2.College of Clinical Medicine of Henan University of Science and Technology,Luoyang 471003,China)

Abstract:ObjectiveTo investigate the research progress of autophagy in inflammatory disease and explore the affection of autophagy on islet beta cells.MethodsRetrieving published literatures at home and abroad, we reviewed autophagy and its possible mechanism in acute or chronic inflammatory models induced by lipopolysaccharide (LPS),and discussed autophagy of beta cells in the pancreatic islet inflammation.ResultsLPS could induce systemic inflammation response with the change of autophagy. Autophagy plays a crucial role in beta cell quantity, structure and function. Deficient autophagy β-cells would be an important factor in the transition from islet inflammation to diabetes.ConclusionAutophagy plays an important role in the pathophysiology of pancreatic beta cell apoptosis and maintaining the balance of inflammation. Autophagy imbalance can lead to a variety of diseases. Regulation of autophagy through drugs may be a novel therapy for inflammatory disease and diabetes.

Key words:autophagy；lipopolysaccharide；inflammation；diabetes mellitus beta cell；apoptosis

文章编号：1672-688X(2016)02-0152-05

DOI：10.15926/j.cnki.issn1672-688x.2016.02.026

中图分类号：R364.5，R587.1;R329.2+8

文献标志码：A

基金项目：国家自然科学基金项目(编号：U1404805)

收稿日期：2016-03-08

作者简介：王霖蕾(1989-)，女，河南获嘉人，从事内分泌及代谢疾病临床工作。

通信作者：姜宏卫，男，博士，副主任医师，E-mail：29202777@qq.com