表面纳米沟槽对成纤维细胞定向行为的影响

崔垚，安宇，金桐宇，张帆，何品刚

（华东师范大学化学与分子工程学院，上海 200241）

表面纳米沟槽对成纤维细胞定向行为的影响

崔垚，安宇，金桐宇，张帆*，何品刚*

（华东师范大学化学与分子工程学院，上海 200241）

在皮肤伤口愈合中，细胞的定向行为对加速伤口愈合起着非常重要的作用。该文采用纳米压印技术制备了线宽为200 nm、周期为400 nm及深度为200 nm的沟槽结构，用于模拟体内的细胞外基质。将成纤维细胞L929培养在纳米沟槽上，观察细胞的延长和铺展方向，对细胞的定向行为进行了定量分析。结果表明，L929细胞在纳米沟槽上具有良好的延长性，并能够沿着纳米沟槽的方向铺展，说明制备的纳米沟槽能够诱导成纤维细胞的定向行为，为皮肤伤口快速愈合的临床研究奠定了基础。

纳米沟槽；成纤维细胞；定向行为

0 引言

皮肤是生命体重要的保护屏障，能够阻挡病原体的侵入、维持体内温度以及防止体液流失，一旦受到伤害，必须及时愈合。在皮肤伤口愈合的过程中，细胞外基质起着非常重要的作用，它包含了大量的纳米纤维类结构成分[1]，这些纳米结构可以诱导细胞的行为，包括繁殖、迁移等[2]。真皮成纤维细胞是伤口愈合中的主要功能细胞之一[3]，当皮肤受到创伤时，成纤维细胞会向伤口定向迁移，使伤口收缩，促进愈合[4]。如果它的行为出现异常，就会造成伤口愈合延缓并留下异常疤痕。因此，诱导受伤组织有效、快速地进行修复，同时减少疤痕形成是非常重要的。

近年来，研究者发现微纳米尺度形貌对细胞行为能够产生很大的影响，其中纳米沟槽是非常重要的类型之一，它由于更加接近人体的真实环境而备受关注[5-6]。纳米沟槽对细胞有很强的“接触引导”作用[6]，可使细胞在特定的方向上铺展、排列、生长、迁移等[7-10]。细胞的定向行为对组织的修复和再生有很大的促进作用，因此，已应用于研究皮肤伤口愈合、骨头再生、干细胞分化等生物过程[8,11-12]。纳米沟槽的尺寸对于细胞定向行为具有很大的影响[13]，为了能够有效诱导皮肤成纤维细胞的定向行为，该文利用纳米压印技术制备了纳米尺度的沟槽结构，并定量分析了成纤维细胞L929在纳米沟槽上的定向行为，对皮肤创伤快速修复的临床研究起到了一定的推动作用，以期推动再生医学和整形科学的发展。

1 实验部分

1.1 试剂与仪器

DMEM培养基、胎牛血清（FBS）、青霉素/链霉素混合液（P/S）和0.25%胰蛋白酶（含EDTA）均购自Gibco公司。台盼蓝溶液、PBS片剂、戊二醛、丙酮和乙醇均购自Sigma公司。成纤维细胞L929购自上海博谷生物科技有限公司。

倒置荧光显微镜（奥林巴斯IX51）购买自奥林巴斯（中国）有限公司。NU-5500E二氧化碳恒温培养箱和NU-425-400E生物安全柜购买自NuAire（美国）公司。CRYOSYSTEM 750液氮储藏罐购自于MVE（美国）公司。SX-500高压灭菌锅，购置于TOMY（日本）公司。恒温水槽CU-600购自于上海一恒科学仪器有限公司。离心机L-600购自于湘仪离心机仪器有限公司。

1.2 纳米沟槽的制备

石英具有良好的生物相容性和透光性，因此用作加工纳米沟槽的基底。首先，在干净、干燥的石英片上涂覆层光刻胶，之后将纳米压印模板压在上面，并施以一定的压力，待光刻胶固化后，移去模板，接着通过反应离子刻蚀技术，在石英基底上得到纳米沟槽结构，最后，将残留的光刻胶去除（图1）。

图1 纳米沟槽制备过程示意图Fig.1Schematic illustration of the nano-grooves fabrication process

1.3 细胞培养

L929细胞培养于由DMEM培养基（89%）、FBS（10%）和P/S（1%）配制而成的培养液中，培养环境为37℃、5%CO2。待细胞汇合度达到80%时，用0.25%胰蛋白酶消化、离心、台盼蓝染色计数后，以2000细胞/cm2接种于纳米沟槽上进行培养。

接种细胞之前，纳米沟槽在丙酮和乙醇溶液中分别浸泡30 min，超声清除表面残留的有机物，接着在蒸馏水中超声清洗15 min，之后，高温（120℃）灭菌20 min，紫外照射1 h。

1.4 细胞定向行为的观察和分析

细胞培养24 h后，选取纳米沟槽上多处不同部位进行显微镜拍照，用于观察细胞的定向行为（以平面石英基底作为对照），同时以细胞之间不能接触且每张照片中细胞数目大于40为原则，选取10张图片进行细胞定向行为的定量分析。

为了进一步观察细胞在纳米沟槽上的定向行为，该文利用扫描电子显微镜（SEM）对细胞进行了表征，表征之前，对细胞进行了固定和脱水，步骤如下：细胞培养24 h后，弃去原有培养液并加入1 mL PBS溶液清洗3次，之后加入2.5%～3.0%戊二醛固定2.5 h，接着依次加入30%、50%、75%、80%、95%和100%（2次）乙醇进行梯度脱水（15 min/次，）干燥后进行SEM拍照。

2 结果与讨论

2.1 纳米线的表征

从SEM和原子力显微镜（AFM）图片中可以看到制备的纳米沟槽方向一致，排列规则，图形完整，线宽和周期分别为200 nm和400 nm，深度为200 nm左右（图2）。

2.2 细胞在纳米沟槽上的定向行为

图2 纳米沟槽的SEM图(A)和AFM图(B)Fig.2SEM image(A)and AFM image(B)of nano-grooves

将L929细胞培养在纳米沟槽上，24 h后，从图3中可以看到大多数细胞是沿着纳米沟槽方向铺展和排列的，且有一定程度的延长，而在平面上，细胞是无序的，向着各个方向延伸和铺展。细胞的SEM图进一步清楚地显示细胞骨架与纳米沟槽方向相一致，细胞呈现出良好的定向性（图4）。

2.3 细胞定向行为的定量分析

为了定量分析L929细胞在纳米沟槽上的定向行为，该文对细胞的延长度和铺展方向进行了统计。首先通过Photoshop软件提取出细胞轮廓，然后由Image J软件拟合成椭圆（图5）。将椭圆的长轴和短轴分别定义为细胞的长和宽，它们之间的比值定义为细胞的延长度（E）[14-15]。如果E大于4，则认为细胞是延长的。同时，将细胞长轴和纳米沟槽方向之间的夹角定义为θ，如果θ小于10°，则认为细胞能够沿着纳米沟槽的方向定向铺展。

图3 L929细胞在纳米沟槽(A)和平面基底(B)上的显微镜图片(箭头表示纳米沟槽方向)Fig.3Microscopic observations of L929 cells on nano-grooves(A)and flat surface(B)(The direction of nano-grooves is indicated by the arrow)

图4 L929细胞在纳米沟槽上的SEM图Fig.4SEM image of L929 cells on nano-grooves

图5 细胞拟合及参数示意图Fig.5Schematic representation of cell fitting and parameters

从细胞延长度的分布情况可以看到（图6A），71.22%细胞的E值大于4，5.96%细胞的E值在3到4之间，说明延长的细胞所占比例是较高的。图6B是细胞与纳米沟槽之间角度的分布情况，显示56.33%细胞的θ小于10度，23.57%细胞的θ在10度到20度之间，表明大部分细胞与纳米沟槽之间的夹角是比较小的，也就是说细胞是沿着纳米沟槽的方向铺展的，表现出良好的定向行为。

图6 L929细胞在纳米沟槽上E值(A)和θ值(B)的统计数据Fig.6Statistical data of E value(A)and alignment angle θ(B)for L929 cells on nano-grooves

3 结论

该文以石英为基底，制备了线宽200 nm、周期400 nm及深度200 nm的沟槽结构，将L929细胞培养在纳米沟槽上，结果表明成纤维细胞L929能够沿着纳米沟槽方向铺展和排列，并有一定的延长，说明细胞在纳米沟槽上产生了良好的定向行为。该文的研究将在一定程度上促进临床皮肤伤口快速愈合研究的发展，对再生医学和整形科学具有重要的意义。

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Effect of nano-grooves on the alignment of fibroblasts

Cui Yao,An Yu,Jin Tong-yu,Zhang Fan*,He Pin-gang*
(School of Chemistry and Molecular Engineering,East China Normal University,Shanghai 200241,China)

The alignment behavior of cells plays a very important role in accelerating skin wound healing.In this paper,nano-imprinting technique was used to fabricate a nano-grooves structure with 200 nm in width of grooves, 400 nm in period and 200 nm in depth,simulating the extracellular matrix in vivo.L929 cells were cultured on the nano-grooves,followed by the observation and quantitative analysis of cell elongation and spreading direction.The results showed that L929 cells could be elongated and spread along the direction of nano-grooves,thus it could be concluded that the prepared nano-grooves could induce the alignment behavior of fibroblasts,which would lay the foundation for the rapid healing of skin wounds in clinical research.

nano-grooves;fibroblasts;cell alignment

国家自然科学基金资助项目（21405049）

*通信联系人,E-mail:fzhang@chem.ecnu.edu.cn;pghe@chem.ecnu.edu.cn