基于酪胺信号放大技术的无液滴数字化酶联免疫反应

夏帆

（生物无机与药物湖北省重点实验室，华中科技大学，湖北武汉 430074）

基于酪胺信号放大技术的无液滴数字化酶联免疫反应

夏帆*

（生物无机与药物湖北省重点实验室，华中科技大学，湖北武汉 430074）

数字化酶联免疫反应，一种单分子计数技术，是最灵敏的免疫方法之一。在传统的酶联免疫反应中，靶蛋白的检测限都在pmol/L级别，但是数字化酶联免疫反应的检测限可以达到fmol/L甚至amol/L。这种技术的关键点在于将每一个酶标记的蛋白分子分别包裹到一个液滴中，以此来加大酶浓度，并完成对单分子的检测。因此这类方法需要用到专门的仪器来制备液滴，使得检测体系非常庞大或复杂。最近，日本科学家Kenji Akama发展了一种无需液滴的数字化酶联免疫技术[1]，这一研究成果发表于近期美国Analytical Chemistry杂志上。

该方法主要利用了催化分子沉积的酪胺信号放大技术。酪胺盐在辣根过氧化物酶（HRP）催化双氧水的反应中形成共价键结合位点，然后与周围的蛋白残基如色氨酸，组氨酸和酪氨酸残基结合，形成大量的生物素残基。具体来讲，第一步：首先把捕捉抗体连接到磁珠上，再和不同浓度的靶蛋白孵育，清洗，并和生物素标记的检测抗体反应。最后将清洗过的反应产物加入到链霉亲和素标记的HRP溶液中，生成磁珠-检测蛋白-检测抗体-HRP的免疫反应产物。第二步：免疫反应产物和生物素标记的酪氨盐反应，并使得生物素标记的酪氨盐沉积在只有HRP标记的磁珠上。第三步：将上述生成的磁珠产物和生物素标记的BV-421，一种合成的荧光聚合物，混匀反应。第四步：利用流式细胞仪检测。利用此方法，该实验室可以检测到139 amol/L的乙型肝炎表面抗原。该方法的特点在于将酶富集在了磁珠表面而不是液滴里，在保障灵敏度的前提下，大大简化了实验步骤，扩大了应用范围。

[1]Akama K,Shirai K,Suzuki S.Droplet-Free Digital Enzyme-Linked Immunosorbent Assay Based on a Tyramide Signal Amplification System[J].Analytical Chemistry,2016,ASAP.

国家自然科学基金资助项目（国家杰出青年基金21525523）

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