小麦麸质蛋白中乳糜泻关联表位的检测方法研究进展

李晶晶,袁娟丽,高金燕,舒　恒,李海飞,陈红兵,*

(1.南昌大学食品科学与技术国家重点实验室,江西南昌 330047;2.南昌大学中德联合研究院,江西南昌 330047;3.南昌大学资源环境与化工学院,江西南昌 330047)



小麦麸质蛋白中乳糜泻关联表位的检测方法研究进展

李晶晶1,2,3,袁娟丽1,2,高金燕1,2,舒恒1,2,李海飞1,2,陈红兵1,2,*

(1.南昌大学食品科学与技术国家重点实验室,江西南昌 330047;2.南昌大学中德联合研究院,江西南昌 330047;3.南昌大学资源环境与化工学院,江西南昌 330047)

乳糜泻关联表位的定量检测可以评价小麦种质资源及加工食品的乳糜泻致敏性,为患者安全消费提供技术保障。定量检测小麦麸质蛋白中致乳糜泻表位的方法包括免疫印迹法、高通量测序法和多反应检测串联质谱检测(LC-MRM/MS),它们在麸质表位的检测中各具特色。免疫印迹法检测结果稳定直观,但定量精确度不高;高通量测序法准确度相对较高,但应用范围窄,且数据处理困难;多反应检测串联质谱检测灵敏度高、样品用量少、分析速度快,但费用较高。

乳糜泻,T细胞表位,麸质蛋白

乳糜泻(celiac disease,CD)是一种自身免疫性疾病,患病率约为0.5%～2%。它是基因易感人群摄入来自小麦、大麦、黑麦及其衍生产品中的麸质蛋白而诱发的T细胞介导的慢性肠炎疾病[1]。小麦中的麸质蛋白的摄入,是引起乳糜泻易感人群发病的诱导因素。目前治疗乳糜泻唯一有效的方法就是终身坚持无麸质饮食[2]。小麦中的麸质蛋白,包括聚合的麦谷蛋白(HMW-GS,LMW-GS)和单体的麦醇溶蛋白(α/β-,γ-,ω-)[3],是影响小麦粉面团粘弹性和烘焙品质的主要因素,同时也存在多种致乳糜泻T细胞表位。含T细胞表位的肽段,至少有9个氨基酸序列,进入粘膜固有层后,在组织型转谷氨酰胺酶(tTG)的作用下,脱去酰胺基,随后被抗原递呈细胞表面的HLA-DQ2和-DQ8分子识别而导致乳糜泻[4-5]。目前,小麦麸质蛋白中,已鉴定出的致乳糜泻核心表位可分为DQ2.5型、DQ2.2型、DQ8型及DQ8.5型四种类型[4]。

根据食品法典委员会规定,只有含量低于20 mg/kg麸质的食品才允许在其预包装上标注“不含麸质”,而“含微量麸质”的标签适用于已经进行特殊处理及去除大量麸质,但食品成分中仍存在低于100 mg/kg麸质的食品[6-8]。然而,乳糜泻的诱因是麸质蛋白上的某些T细胞表位,部分麸质蛋白富含这类T细胞表位,特别是来自α-醇溶蛋白中的33肽,含6个T细胞表位[5,9-10]。而有些麸质蛋白缺失这些表位[11]。另外,核心表位中单个氨基酸或多个氨基酸的替换或缺失,会使其失去T细胞刺激能力,即丧失致敏性[12]。由此可见,用麸质含量的高低评估小麦品种及其制品的乳糜泻致敏性不科学,准确定量小麦麸质蛋白中的T细胞表位凸显重要。迄今为止,基于T细胞表位的定量检测可以评价种质资源的乳糜泻致敏性,直接获得或选育获得低致敏甚至是无致敏性的种质资源,有望从源头上解决原料问题,从而为乳糜泻患者提供安全可靠的低麸质食品;其次,可以科学评价加工食品中乳糜泻致敏性,保障无麸质食品标签的准确性。

1　致乳糜泻表位检测方法

目前能准确定量麸质蛋白中致乳糜泻表位检测方法主要包括免疫印迹法,高通量测序法以及多反应检测串联质谱检测法。

1.1免疫印迹法

免疫印迹法是在SDS-PAGE凝胶电泳和固相免疫测定技术基础上发展起来的一种新的免疫生化技术[13]。基于该原理,荷兰学者Hetty[14]创建了定量检测麸质蛋白中致乳糜泻T细胞表位的方法。

该方法的主要操作程序如下。首先通过SDS-PAGE结合PageBlueTM染色鉴定提取出的麸质蛋白,然后,采用基于致乳糜泻T细胞表位单克隆抗体Glia-α9和Glia-α20,进行蛋白质免疫印迹。最后,使用Quantity One软件对印迹条带强度进行灰度扫描,与参照的标准六倍体小麦对比分析来定量比较分析待测小麦种质中乳糜泻T细胞表位含量。

在实际应用中,Hetty利用此方法,以致敏性较强的六倍体小麦Bovictus为对照品种,评价了103种四倍体小麦品种的乳糜泻致敏性,确定了14个致敏性相对较低的品种。2013年,本实验室率先引进该技术,并开展了相应的研究工作。如,朱晓燕[15]评价了80个中国六倍体小麦品种,发现浙江温麦8号品种的乳糜泻致敏性相对最低,为我国进一步选育低乳糜泻致敏性的小麦品质提供了示范。免疫印迹法主要应用于筛查小麦种质的致乳糜泻T细胞表位含量,但也可用于评价加工食品的乳糜泻致敏性。如吕崇富[16]评价了挤压加工对面粉麸质蛋白结构和致敏性的影响,于凤莲[17]评估了新疆小麦及主要面制品馕的乳糜泻致敏性,这对乳糜泻患者的健康饮食具有指导意义。

免疫印迹技术本身受到环境因素的影响比较多,在精确定量上存在不稳定性。但免疫印迹法具有高分辨力和固相免疫测定的高特异性及敏感性等优点,操作方便,成本低且适合大量样品的筛选,而且是验室常规方法。另外,采用免疫印迹法可以较直观地观察出不同品种麸质蛋白的种类与含量的差异,也可反映单克隆抗体的特异性免疫反映强弱程度。由此可见,基于免疫印迹定量检测麸质蛋白中致乳糜泻T细胞表位的方法易于推广。

1.2高通量测序法

迄今为止,DNA的高通量测序主要有三大技术,包括Roche 454、Illumina Solexa及ABI SoLiD[18-20]。它能一次性对数百万到十亿条DNA分子进行并行测序,使其可以对一个物种的转录组和基因组进行深入细致的分析,所以又称深度测序或下一代测序技术[21]。人们利用高通量测序法可以从基因水平定量小麦麸质蛋白中的致乳糜泻表位。该方法的主要操作程序如下。首先,制备mRNA样本,小麦抽穗后,采摘开花21 d后的小麦颗粒,提取和纯化mRNA。其次,构建cDNA文库,用于后续反应。然后,PCR扩增含待检测表位的肽段,选择合适的测序平台,上机测序。最后,数据分析,利用高通量测序特有的定量功能,计算出各扩增肽段的丰度值,再根据致乳糜泻表位在各扩增肽段中的分布情况,定量待检测表位含量。

Elma[22]等利用DNA高通量测序原理,建立了一种基于454深度RNA扩增子测序法,对发育时期的77种小麦颗粒中含乳糜泻表位片段进行表达谱分析,定量出各小麦种质α-gliadins片段中的三个主要表位(DQ2.5-Glia-α1、α2、α3)及变体含量。结果发现,平均每个品种的α-gliadins转录本含1.81个DQ2.5型表位。其中,地方品种Dibillik Sinde转录本中所含表位丰度值最低。遗憾的是通过此方法并未找到不含T细胞表位的小麦品种,但此方法作为一种新的分析工具,通过检测小麦胚乳中表位含量,可以筛选潜在低致敏的小麦品种。该方法有两个突出创新点:一,选择Roche 454测序平台,Roche 454边合成边测序[23],无拼接过程,可确定各个表位在麸质肽段中的分布情况。因此,消除了小麦醇溶蛋白的高同源性对结果影响[24-25]。二,通过分析3,000多种已知α-gliadins片段核酸序列,设计一对简并引物,扩增出小麦发育时期时,转录组中不同的α-gliadins片段,可避免小麦种质基因组中终止密码子和假基因对结果的干扰[12]。Carmen[26]等则通过高通量测序对小麦属和山羊草属中的α麦醇溶蛋白基因组片段进行分析,确定了六种表位含量明显不同的α麦醇溶蛋白片段,并建立了小麦中α-gliadins的进化模型,对低丰度表位的小麦育种具有重要的作用。

基于DNA高通量测序法是一种用非免疫学技术检测麸质蛋白表位含量的方法,此方法突破了先前研究中T细胞克隆及单克隆抗体的局限性[27-28],首次将麸质蛋白中的表位做了精确定量分析。但是,高通量测序法也存在一些不足,此方法主要通过mRNA水平定量麸质蛋白中的致乳糜泻表位,但mRNA水平与蛋白水平有一定的差异,且蛋白成分可能在小麦发育期发生改变[29-31],从而影响了实验结果的准确性。此外,测序费用较高,后续海量测序数据的分析是一大难题[32],只适合对小麦种质资源进行分析,不适用于食品行业的现场快速检测。

1.3多反应检测串联质谱检测

多反应检测串联质谱(Liquid chromatography-multiple reaction monitoring mass spectrometry,LC-MRM/MS)是一种基于已知信息或假定信息有针对性地获取数据,进行质谱信号采集的技术[33-34]。基于LC-MRM/MS高通量检测肽原理[35],可以同时定量检测小麦麸质蛋白中的多个特异性致乳糜泻表位,荷兰学者Hetty[34]率先创建了该方法。

在早期研究中,根据质谱模式图定量麸质蛋白,但检测线性范围窄,不适用于低麸质或无麸质蛋白食物样本的检测。Sealey[36]等则建立了液质连用(LC-MS)定量麸质蛋白的方法,检测线性范围相对提高。但由于小麦麸质蛋白同源性高,致敏肽段中氨基酸的替换会影响结果的准确性[12]。而LC-MRM/MS可同时检测并定量多种致乳糜泻肽段表位。首先,合成待检测的肽段表位作为标准样品,其次,确定麸质蛋白消化时释放待检测肽段的最优条件,最后,通过质谱分析法检测并定量乳糜泻抗原表位。

Hetty[34]等采用LC-MRM/MS方法分析了四倍体小麦品种Dibillik Sinde、六倍体小麦老品种Minaret及新品种Toronto中以下9种含T细胞表位肽段含量:LQLQPFPQPQLPY、LQLQPFPQPQLPYPQPHLPY PQPQPF、LQLQPFPQPQLPYPQPQPF、LQLQPFPQPQ LPYP、QPQLPYPQPQPF、RPQQPYPQPQPQY、RPQQPY PQSQPQY、QQQLIPCRDVVL、QQILQQQLI PCRDVVL。结果发现相对于Minaret和Dibillik Sinde两个品种,Toronto含乳糜泻表位最多。该方法的精确度主要依赖于麸质蛋白最优消化条件的确定[37]。其次,是检测水平的提高,质谱高的灵敏性和特异性,可以识别出单个氨基酸替换,从而区别免疫原性肽和非免疫原性肽[34]。

LC-MRM/MS结合了液质连用与质谱多反应监测的优点,实现了一种灵敏度高、样品用量少、分析速度快、重现性高的检测方法。不仅可以分析低麸质中的致乳糜泻表位含量,还可以检测分析一些由于氨基酸替换,使得免疫活性下降甚至对于乳糜泻患者来说是安全的肽段。由于该方法可以分析不同小麦品种中表位含量,对低致敏小麦品种的育种,食品中免疫显性表位的检测分析提供了广阔的应用前景。但是,此方法依赖贵重设备,待检测样品需要前处理,存在费用较高、费时费力等缺点。

2　总结

与小麦麸质相关的过敏性疾病分为三大类,包括自身免疫型、过敏型以及非自身免疫非过敏型[38]。国外对与麸质相关的疾病系统地研究了多年,并取得了阶段性的成果[39]。乳糜泻是一种自身免疫型食物过敏疾病,其致病机理是所有与麸质相关疾病中研究最为透彻的[40-41]。因此,准确定量麸质蛋白中的致乳糜泻T细胞表位,对低麸质和无麸质产品研发、标签标示的制定至关重要。众所周知,各种定量方法是保障食品安全的支撑技术。因此,本文介绍的方法不仅可以为乳糜泻患者安全消费提供技术支撑,还可以为其它食物过敏原的检测提供参考。另外,国内相关工作虽然刚刚起步,但是我国小麦种质资源丰富,通过现有的检测方法,有望发现出低致敏甚至是无致敏的小麦品种,为乳糜泻患者提供安全的食品原料。同时,我国无麸质食品研发尚在研发阶段,这些检测技术的应用将起到雪中送炭的作用。

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Progress in detection methods for epitopes related to celiac disease in wheat gluten

LI Jing-jing1,2,3,YUAN Juan-li1,2,Gao Jin-yan1,2,SHU Heng1,2,LI Hai-fei1,2,CHEN Hong-bing1,2,*

(1.State Key Laboratory of Food Science and Technology,Nanchang University,Nanchang 330047,China;2.Sino-German Joint Research Institute,Nanchang University,Nanchang 330047,China;3.School of Environmental and Chemical Engineering,Nanchang University,Nanchang 330047,China)

Detection of epitopes in gluten related to celiac disease can evaluate the sensitivity of wheat variety resources and the relevant food,and it is a strong technical support for the safety consumption for celiac disease patients.The main methods used in the detection of epitopes related to celiac disease in wheat gluten involve three approaches based on western blotting,next-generation sequencing,LC-MRM/MS,respectively.The advantages and disadvantages of these methods were introduced in detail.Among them,western blotting could present direct results,while the quantitative accuracy was not high.The accuracy of next-generation sequencing is relatively high,while the range of application is narrow with a complicated data processing.LC-MRM/MS has advantages on high sensitivity,low sample consumption and fast analysis speed with higher cost.

celiac disease;T cell epitope;gluten

2015-10-16

李晶晶(1990-)，女，硕士研究生，研究方向：生物加工工程，E-mail：ljjncu@163.com。

陈红兵(1967-)，男，博士，教授，研究方向：食品科学，E-mail：chenhongbing@ncu.edu.cn。

科技部国际科技合作专项(2013DFG31380)；江西省对外科技合作计划(2012BDH80019)；江西省科技计划项目(20132BBG70101)。

TS207.3

A

1002-0306(2016)09-0380-04

10.13386/j.issn1002-0306.2016.09.067