分子生物学方法检测沙门氏菌的研究进展

杨　柳,胡文忠,*,姜爱丽,冯　可,2,王　馨

(1.大连民族大学生命科学学院,辽宁大连 116600;2.大连理工大学生命科学与技术学院,辽宁大连 116024)



分子生物学方法检测沙门氏菌的研究进展

杨柳1,胡文忠1,*,姜爱丽1,冯可1,2,王馨1

(1.大连民族大学生命科学学院,辽宁大连 116600;2.大连理工大学生命科学与技术学院,辽宁大连 116024)

沙门氏菌是一种能引起人畜共患病的病原菌,由其引起的食物中毒事件屡居首位,在食品致病菌的检测中,沙门氏菌的检测是尤为重要的。本文针对目前检测食品中的沙门氏菌常用的分子生物学方法,包括三种PCR技术、基因芯片技术、环介导等温技术和焦磷酸测序技术进行了综述,对分子生物学快速检测技术与其他学科技术的联合使用做简单的介绍,并对这些技术的未来发展进行展望。

分子生物学,沙门氏菌,聚合酶链式反应,检测技术

沙门氏菌是一种革兰氏阴性杆菌,菌群的种类众多,由于沙门氏菌对营养的要求不高,所以其分布很广泛,是一种能够引起人和畜患病的病原体。肉类(尤其是禽肉)、海产品、蛋类等许多食品都与沙门氏菌病有关,原因是这些食品中含有的营养成分非常丰富,使沙门氏菌生长繁殖速度快,人类摄入含大量沙门氏菌的食品就会引起细菌性感染,进而引发食物中毒[1]。在很多相关的报道中指出生肉是沙门氏菌污染的主要食品[2-4]。在我国,每年发生的细菌性食物中毒事件中,由沙门氏菌引起的食物中毒屡居首位,约占40%[5]。

沙门氏菌的检测在食源性致病菌的检测中处于一个重要的位置。目前,包括我国在内的许多国家对沙门氏菌的检验普遍采用传统培养方法,得出检验结果大致需4～5 d[6],该方法耗时长,操作复杂,无法满足市场需求。近几十年来,随着分子生物学持续快速地发展,分子生物学方法用于鉴定食源性致病菌的研究也越来越深入,如今多重PCR检测和在分子生物学基础上研发试剂盒已经成为国内外研究的热点,在该领域的研究者也倾向于把分子生物学与微型计算机相结合研发新的检测技术,各种生物传感器检测致病菌的方法也在不断地被挖掘。常用于检测沙门氏菌的分子生物学方法主要包括聚合酶链式反应(PCR)、荧光定量PCR、基因芯片技术、环介导等温扩增技术等[7-9]。

1　聚合酶链式反应(PCR)技术

1.1常规PCR技术

聚合酶链式反应是一种用于放大扩增特定DNA片段的分子生物学技术,是DNA在体外模拟体内进行快速复制的过程。宫强等人[10]根据鼠伤寒沙门氏菌的ompc基因序列设计合成了一对特异性引物对该基因进行特异性扩增,最低检测限达到了1 pg/μL,减少了实验成本和实验时间。Radhika等[11]用invA基因设计一对引物并特异性地检测出了致病性的沙门氏菌,而在非沙门氏菌中并没有发现invA基因。当实验中只有一种基因进行检测的时候,检出限相对较低,并且其特异性也很强。武晓松等人[12]建立了应用于检测蔬菜中沙门氏菌的PCR检测方法,对180份市售蔬菜样品进行检测,6份样品检出沙门氏菌,检出率为3.33%。经过实验人员的检测并将这些实验方法运用于食品的检测中发现,与传统的生化检测方法相比,PCR技术检测致病菌更加省时,灵敏度方面也有了很大的提高,但是其成本还是相对较高,而且有假阳性的现象产生。

1.2多重PCR技术

多重PCR是指在同一个反应体系中,加入与所测目标菌对应的多对特异性引物,如果能够得到与这些引物特异性互补的模板,则可同时在同一反应体系中扩增出多条目的基因片段。其反应原理与常规PCR一样,只是所用的引物为多对。李凤梅等人[13]对沙门氏菌的invA基因、fliC基因和spvR基因设计三对特异性引物,建立了一个同时检测鸡源致病性沙门氏菌的多重PCR体系,并且得到的检出限为4.5×102cfu/mL。冯飞等人[14]分别根据沙门氏菌16S rRNA,质粒毒力基因spvC和致病基因 invB、fimA设计4对引物对沙门氏菌进行检测,实验中经过一次增菌,并能实现12 h内在人工污染的食品样品中检测出沙门氏菌,且灵敏度达到了102cfu/mL。闫晗等人[15]以大肠杆菌的phoA基因、金黄色葡萄球菌的nucA基因和沙门氏菌的invA基因对乳中的这三种致病菌进行多重PCR实验,结果表明多重PCR检测方法与国家标准中常规的细菌学检测方法相比在时间上缩短了12～24 h。研究中,实验者用多种具有同源性的基因进行了测试,实验结果都表明了多重PCR大大缩短了检测时间,提高了检测的灵敏度,减少了成本,并且在实验中对实验条件进行优化后基因条带都明显得到扩增而没有出现杂带,说明其具有很强的抗干扰性。

多重PCR技术是在单重PCR技术的基础上进行改良优化的。常规的PCR反应只检测一种致病菌,而多重PCR实现了在同一个反应体系中同时检测两种或两种以上的致病菌。在这样多种致病菌同时检测的情况下,大大减少了检测所需要的时间,降低了成本。引物的设计对多重PCR实验成功的影响很大,各引物之间是否设计得合理,是否会造成相互污染是必须考虑的首要问题。食物中的各种成分也会对实验的结果造成不同程度的影响,所以在进行PCR实验时,尽量避免人为的污染,以减少实验误差。

1.3荧光定量PCR技术

荧光定量PCR是指在PCR反应体系中加入荧光物质,利用荧光信号的积累实时监测整个PCR过程,最后通过绘制已知浓度的标准液的标准曲线对被测模板进行定量分析的方法。传统的定量PCR从细菌的培养到扩增再到电泳,这个过程非常耗时,只能在终点检测,而实时荧光定量PCR不需要加入内标,并有效地解决了传统定量PCR只能在终点检测的劣势。现今,荧光定量PCR实验也发展到了多重检测的阶段,多重荧光定量PCR实验也是国内外近年来一直在积极研究的一个方向。魏琼[16]选择沙门氏菌的invA基因、志贺氏菌的ipaH基因和金黄色葡萄球菌的nuc基因进行三重荧光定量PCR实验,其利用建立好的体系直接检测模拟感染细菌样品,最低检出限为102cfu/g。杨美荣[17]等人将荧光定量PCR技术应用于饲料中沙门氏菌的检测中,将荧光定量PCR技术检测三种样品的检测结果与国家标准方法检测结果进行对比,结果表明了荧光定量PCR技术的特异性更强,其检测结果与国家标准方法检测的实验结果相符,能对饲料进行有效的检测,具有省时省力的特点。与行业标准SNT1059.7-2010[18]中对沙门氏菌增菌液检测的检出限240 cfu/mL相比,研究人员对实时荧光定量PCR技术进行了优化,实验结果表明检出限远低于标准中所规定的检出限。

与多重PCR检测技术相比,荧光定量PCR技术是菌的扩增和检测做到了一步完成,省去了电泳的过程,更快地得到检测结果。而且这个方法的操作更简单且自动化的程度更高,同时也不需要后期的处理。与普通PCR技术相比,该方法人为污染的可能性更低。但是Jacobsen等[19]研究表明,以DNA为基础的荧光定量PCR不能有效地区别死菌和活菌,所以这种检测技术不适用于含有加热致死的菌体的样品,如加工肉制品、即食食品中的沙门氏菌的检测,比较适用于生鲜食品的检测。

2　基因芯片技术

1991年Fodor等人提出了生物芯片的概念[20]。基因芯片属于这其中最早的一种芯片,是指DNA片段经过PCR扩增之后,将这些基因序列标记为未知靶基因序列,将其与集合了大量已知序列探针的基因芯片上特定的基因位点上的探针进行杂交,再通过检测杂交信号来对基因信息进行分析[21-22]。基因芯片技术在医学、植物基因检测、生命科学研究、食品研究及检测等方面应用也比较广泛[23-26]。陈昱等人[27]通过设计志贺氏菌ipaH基因、沙门氏菌stn基因和大肠杆菌O157的slt基因的三对特异性引物,用多重PCR技术和基因芯片技术相结合对人工模拟样品和实际样品进行检测,实验结果表明这两种方法相互结合检测这三种菌的灵敏度都可达到50 cfu/mL,而多重PCR电泳的检测的灵敏度为500 cfu/mL。通过对比实验发现基因芯片技术不仅在自动化的程度上高于PCR技术,其在检测灵敏度上也相对较高。基因芯片技术是分子生物学与计算机应用的一种融合,只是目前还没有具体的标准对基因芯片技术进行一个综合性的说明。

3　环介导等温扩增技术

环介导等温扩增技术简称LAMP技术,是利用具有链置换活性的BstDNA 聚合酶,通过识别靶序列上6段特异区域的2条内引物(FIP 和BIP)和2条外引物(F3和B3)在恒温条件下短时间内催化合成新的链,并通过靶基因的扩增产物产生反应出现的焦磷酸镁的白色沉淀来判断靶基因是否存在[28-30]。田桢干等人[31]运用LAMP技术针对沙门氏菌的agfA基因进行引物设计,并对54株临床分离的阳性样本加以验证,实验结果表明分离样本的符合率达到100%。LAMP技术不仅在检测的准确率上很高,而且它的灵敏度与普通PCR技术相比也要高出很多。王润鑫[32]针对沙门氏菌的invA基因进行LAMP引物的改良并检测,而庞心怡等人[33]用沙门氏菌的特异性基因invA设计引物,并用LAMP技术和PCR技术对人工污染的样品和实际样品进行检测,他们的结果表明都表明LAMP技术的灵敏度可以达到普通PCR技术的100倍。相对于其他的实验方法,LAMP技术操作更简单,灵敏度和准确性更高,而且其所需的仪器和试剂相对于PCR技术更低,耗时短[34-35]。

在此基础之上衍生出了实时荧光LAMP技术。实时荧光LAMP技术是在LAMP反应体系中加入发光的荧光基团,利用荧光信号对LAMP反应进行实时监测,该方法快捷方便、特异性和灵敏度高,并且可以在源头上控制气溶胶对反应的污染[36]。虽然LAMP技术一直在改良,但是这一技术还是存在很多问题。比如在引物上的设计它相对于PCR技术来说要难,而且要筛选出合适的引物还需要大量的工作来验证引物的可靠性,不合理的引物放在同一个管内反应出现假阳性的可能性比较大[37]。如今LAMP技术与实时监测、酶联免疫吸附实验、纳米金技术、电化学生物传感器、芯片实验室等技术的联用,促进了LAMP技术的推广,通过改良,实验检测的过程更简单、而且自动化的程度更高,结果也更加直观和准确,使其在引物设计与产物的特异性检测和分离等方面的缺陷得到了更好的改进和发展,在简便性、敏感性以及快速性等方面的优点更加突出,更加适用于基层和实地使用[36,38-39]。

4　焦磷酸测序技术

焦磷酸测序技术是近年发展起来的基于分子水平上的一项快速、准确检测DNA短序列的微生物检测技术,并广泛地应用于病毒检测[40]、微生物检测[41]和SNP分析[42]等方面。Islam等人[43]使用新一代16s rRNA基因焦磷酸测序技术,发现了门变形菌门主导OSPW和生物膜,进一步深入分析显示较高丰度的α-和γ-变形菌序列。曹冬梅等人[44]设计了测序引物和扩增引物对鼠伤寒沙门氏菌的特异性序列进行了检测,该实验耗时短,与GenBank中已知的鼠伤寒沙门氏菌DNA序列相比,检测所得的序列的匹配率为100%。焦磷酸测序技术做到了将微生物进行最本质的序列检测,这样在很大程度上提高了检测结果的准确性。

5　分子生物学方法检测致病菌的发展前景

本文中的快速检测方法均为研究人员经过实验条件的优化最终得到了较为理想的结果,这些分子生物学快速检测方法在其最优的反应和实验条件下,实验结果表明了其有检出限低,检测时间与传统生理生化检测时间相比大大减少,灵敏度和准确率都达到了一个理想的水平。目前,致病菌快速检测的标准基本上均为行业标准而没有上升到国家标准,只有部分检测标准说明了在该标准所优化的实验条件下的检出限比如SNT1059.7-2010[18]。在检测标准如GBT13091-2002[45]、SNT2641-2010[46]、SN/T2651-2010[47]等中只对结果的判定方法进行了说明,而没有对实验的稳定性、准确定和抗干扰性等进行一个系统的规定。

经过几十年的发展,分子生物学方法的优势越来越明显,但是单一的分子生物学检测方法检测沙门氏菌都还存在很多待解决的问题,比如在检测中如何减少甚至避免假阳性的出现或者通过某一种方法达到只检测出活菌而避免,实验的准确性需要进一步提高,实验过程中出现的人为误差是造成实验失败的主要原因,所以检测技术实现自动化以及计算机与分子生物技术的结合对未来致病菌的检测尤为重要。近年来,分子生物学方法与其他学期进行结合并对检测方法不断地进行改良取得了可喜的研究进展。比如盛翔宇等人[47]用PCR-HRM方法对32株沙门氏菌的fljB、gyrB和ycfQ 3个目的基因进行分型,其分析正确率为96.9%。金玉娟等人[48]运用液相芯片技术联合多重PCR检测副溶血性弧菌tdh基因、沙门菌inv A基因、单增李斯特氏菌hly A基因和肠出血性大肠埃希氏菌的stx1基因和stx2基因也取得了很好的实验结果。沙门氏菌的快速检测方法在不断发展,很多试剂盒在不断被开发。比如姜彦君等人[49]根据沙门氏菌的invA基因、大肠杆菌O157的fliC基因和金黄色葡萄球菌的Nuc基因设计特异性引物,建立了一套快速而且能准确检测这三种致病菌的试剂盒,这一试剂盒的稳定性强、准确度高、所耗时间少。目前,国内对致病菌的PCR试剂盒的研发也有很高的关注,针对沙门氏菌的各种商品试剂盒就有十来种,但是这一技术相对于国外来说还不是很成熟,所以在试剂盒的建立上还有很大的发展空间。基于分子生物学技术开发的试剂盒的使用和分子生物学与其他检测技术的联合,更简便、快捷的检测食品中沙门氏菌的污染情况,各学科间的相互借鉴对沙门氏菌的快速检测可能会成为今后的研究热点。

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Research progress in molecular biology methods for detection ofSalmonella

YANG Liu1,HU Wen-zhong1,*,JIANG Ai-li1,FENG Ke1,2,WANG Xin1

(College of Life Science,Dalian Nationalities University,Key Laboratory of Biochemical Engineering,The State Ethnic Affairs Commission-Ministry of Education,Dalian 116600,China;2.College of Life Science and Biotechnology,Dalian University of Technology,Dalian 116024,China)

Salmonellais a kind of pathogenic bacteria that can cause human and animal diseases,and it is the first place that the food poisoning incidents caused by them.This paper make a simple summary that aim at the methods of molecular biology for the detection ofSalmonellain food,include three PCR technology,gene chip technology,loop mediated isothermal technology and pyrosequencing,to do a simple introduction of rapid testing of molecular biology technology in conjunction with other disciplines,and to prospects for the future development of these technologies.

molecular biology;Salmonella;PCR;detection technology

2015-11-24

杨柳(1989-)，女，硕士研究生，研究方向：食源性致病菌检测，E-mail：771084886@qq.com。

胡文忠(1959-)，男，博士，教授，研究方向：采后生物学与技术，E-mail：hwz@dlnu.edu.cn。

国家科技支撑计划项目(2012BAD38B05)；国家自然科学基金项目(31172009)；大连市科技计划项目(2012E13SF106)；大连市金州新区科技计划项目(2012-A1-049)。

TS207.4

A

1002-0306(2016)09-0372-05

10.13386/j.issn1002-0306.2016.09.065