黄芪甲苷对慢性心力衰竭大鼠心肌纤维化和结缔组织生长因子表达的影响

蒋洪强，张金国，谭洪勇，尉希清



黄芪甲苷对慢性心力衰竭大鼠心肌纤维化和结缔组织生长因子表达的影响

蒋洪强，张金国，谭洪勇，尉希清

摘要

关键词黄芪甲苷；心力衰竭；结缔组织生长因子；心肌纤维化

作者单位：250100 山东省济南市，山东大学医学院 内科学（蒋洪强 ）；济宁医学院附属医院 心内二科（张金国、谭洪勇、尉希清）

Effects of Astragaloside IV on Myocardial Fibrosis and Connective Tissue Growth Factor Expression in Experimental Rats With Chronic Heart Failure

JIANG Hong-qiang, ZHANG Jin-guo, TAN Hong-yong, WEI Xi-qing.
Department of Medicine, Shandong University Medical College, Jinan (250100), Shandong, China
Corresponding Author: ZHANG Jin-guo, Email: cck112000@aliyun.com

Abstract

Objective: To observe the effects of astragaloside IV on myocardial fibrosis and connective tissue growth factor (CTGF) expression in experimental rats with chronic heart failure (CHF).

Methods: CHF model was established by abdominal aorta constriction (AAC) and the rats were divided into 5 groups: Sham operation group, the rats received normal saline 2 ml/day, n=10, CHF group, the rats received normal saline 2 ml/day, n=12; Astragaloside IV groups, CHF rats received astragaloside IV at (20, 40, 60) mg/kg respectively and n=12 in each group.All animals were treated for 4 weeks.Hemodynamic indexes were monitored, left ventricular mass index (LVMI) was calculated, morphologic changes of myocardial tissue was observed by HE staining, myocardial fibrosis degree and collagen volume fraction (CVF) were measured by Masson staining.The mRNA and protein expressions of CTGF were detected by RT-PCR and immunohistochemistry, Western-blot analysis respectivety.

Results: Compared with CHF group, 3 Astragaloside IV groups had decreased LVMI and CVF, P<0.05-0.01; Astragaloside IV (40 and 60) mg/kg groups presented decreased LVEDP and LVSP, increased ±dp/dtmax, P<0.01 to P<0.05 and improved pathologicalmorphology.Compared with Sham group, CHF group had increased average CTGF OD value (0.09 ± 0.03) vs (0.45 ± 0.04) and increased expression of myocardial CTGF (0.57 ± 0.06); compared with CHF group, the average CTGF OD values in Astragaloside IV (20, 40, 60) mg/kg groups were all decreased (0.39 ± 0.05), (0.30 ± 0.06), (0.24 ± 0.04) and decreased expressions of myocardial CTGF (0.44 ± 0.05), (0.35 ± 0.02), (0.28 ± 0.03) respectively, all P<0.01.

Conclusion: Astragaloside IV can inhibit myocardial fibrosis and improve cardiac function in CHF rats, which might be via inhibiting the over expression of myocardial CTGF.

Key words Astragaloside IV; Heart failure; Connective tissue growth factor; Myocardial fibrosis

(Chinese Circulation Journal, 2016,31:165.)

慢性心力衰竭（CHF）是各种器质性心脏疾患的最终归宿，5年的存活率和恶性肿瘤相似[1]。在中国34～74岁之间的年龄段的人群，就有超过400万的心力衰竭（心衰）患者，年死亡率更是高达40%，同时心衰的患者数量不断增加，年增长率已达2.8%[2]。心肌纤维化是慢性心衰的重要特征，而结缔组织生长因子（CTGF）是最近几年发现与心肌纤维化密切相关的细胞因子[3]。黄芪甲苷是中药黄芪制剂中的主要活性成分，其含量是黄芪制剂的质量控制标准。黄芪甲苷具有抗炎、免疫调节、抗氧化等多效性的作用[4]，本研究应用黄芪甲苷干预CHF大鼠模型，观察其对心肌纤维化、心室重构等影响，进一步探讨黄芪甲苷的CHF保护作用是否通过抑制CTGF的表达有关。

1　材料与方法

材料及仪器：SD雄性大鼠100只（山东鲁抗医药提供，生产许可证号：scxk鲁20130001），体重280～300 g；10 %水合氯醛；青霉素（80万U/支，山东鲁抗医药提供）。BL-420生物机能实验系统（成都泰盟公司）,ChemiDocMP成像分析系统。黄芪甲苷（纯度＞98%，南京青泽医药公司），兔抗鼠多克隆抗体CTGF、甘油醛-3-磷酸脱氢酶（USA，Proteintech），Masson染色、逆转录酶聚合酶链式反应（RT-PCR）、免疫组化（SP）试剂盒（北京中杉金桥公司）,盐酸缓冲液PBS（NaCl，KCl，Na2HPO4，K2HPO4，pH7.4），TBSP缓冲液（Tris-HCl，Nacl，Tween20，pH7.4）。

腹主动脉缩窄术致CHF大鼠模型的建立：100只大鼠按照参考文献[5]操作建立模型，其中有10只大鼠仅穿线而不结扎腹主动脉，术后连续3 d给予腹腔注射青霉素（20万U/只），常规喂养8周。术后第8周90只行腹主动脉缩窄术的大鼠存活53只（58.9%），随机抽取5只大鼠行血液动力学监测，左心室舒张末期压力（LVEDP）均大于15 mmHg （1 mmHg=0.133 kPa）,提示CHF模型成功建立。

实验分组：假手术组：仅穿线而不结扎腹主动脉大鼠（n=10）, 每日给予2ml生理盐水；48只CHF模型大鼠平均分为4组（n=12），即（1）模型组:每日给予2 ml生理盐水；（2）黄芪甲苷不同浓度3个组：每天给予2 ml不同剂量黄芪甲苷溶液（低剂量组20 mg/kg；中剂量组40 mg/kg；高剂量组60 mg/kg）。连续给药4周。

心脏血液动力学指标检测：给药第4周后，5组大鼠按照实验操作进行血流动力学检测，记录并分析LVEDP、左心室内压最大变化速率（±dp/dt max）、左心室收缩压（LVSP）等指标。

心脏组织采集：待血液动力学指标测量完成后取出心脏，计算左心室质量/体重（LVW/BW，即LVMI）、心脏质量/体重（HW/BW）,同时取大约0.5 cm厚的左心室组织置于4%多聚甲醛中用来包埋、切片（4 μm），以备苏木素伊红（HE）、Masson以及免疫组化染色，剩余组织用于蛋白免疫印迹（Western-blot）实验。

心肌胶原容积分数（CVF）的测定：按照Masson染色试剂盒的说明进行操作，在光学显微镜下进行观察，每只大鼠取4个不含血管的视野进行IPP6.0图像分析系统处理，计算胶原组织所占面积的百分比，取平均值作为每只大鼠的CVF。

RT-PCR检测大鼠心肌组织中CTGF mRNA的表达:取上述新鲜组织，用生理盐水灌洗后，按Trizol试剂盒以及RT-PCR进行操作，凝胶扫描分析仪计算目的带吸光度值，CTGF mRNA 表达的相对强度= CTGF条带灰度值/GAPDH条带灰度值。

大鼠心肌组织CTGF的表达：参照SP试剂盒说明书进行操作，CTGF体积稀释度1:200，利用图像采集系统操作，随机取每张图片中的5个视野进行积分光密度值的测定，取其平均值作为标本值。Western-blot按照实验操作手册进行，CTGF体积稀释度1:1 000；甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）体积稀释度1:2 000，最后用ChemiDocMP成像分析系统采集图像，用积分吸光度比值（CTGF/GAPDH）作为其相对表达量。

2　结果

各组大鼠的一般情况：假手术组大鼠未见明显异常，模型组大鼠皮毛不整，活动量减少，呼吸急促，肢体出现水肿；各用药物组皮毛不整、呼吸急促、肢体水肿等明显改善，灌胃给药结束后模型组1只大鼠因慢性心力衰竭急性发作死亡。余组未见死亡。

各组大鼠血液动力学指标监测结果比较（表1）：与假手术组相比，模型组大鼠的LVEDP、LVSP明显上升，±dp/dt max显著下降；与模型组相比，黄芪甲苷中剂量组和高剂量组的LVEDP、LVSP明显下降，±dp/dt max显著上升，黄芪甲苷低剂量组仅LVSP降低。上述比较差异均有统计学意义（P<0.05）。

各组大鼠HW/BW、LVW/BW比值的比较（表1）：与假手术组相比，模型组大鼠HW/BW、LVW/ BW的比值明显升高，黄芪甲苷低、中、高剂量组较模型组均有降低，随着的黄芪甲苷剂量的升高，下降的幅度越大，具有明显的剂量依赖性。差异均有统计学意义（P<0.05）。

表1　各组大鼠血液动力学指标测定结果及HW/BW、LVW/BW结果比较（±s）

表1　各组大鼠血液动力学指标测定结果及HW/BW、LVW/BW结果比较（±s）

注：LVEDP:左心室舒张末期压力；LVSP：左心室收缩压；+dp/dt max：左心室内压最大上升速率；－dp/dt max：左心室内压最大下降速率。HW/ BW：心脏质量/体重；LVW/BW：左心室质量/体重。▲：灌胃给药结束后模型组死亡大鼠1只。与假手术组相比*P<0.01；与模型组相比△P<0.05△△P<0.01。1 mmHg=0.133 kPa

组别　数量(只) LVEDP (mmHg) 　 LVSP (mmHg)　 +dp/dt max (mmHg/s) -dp/dt max (mmHg/s) HW/BW (mg/g)　 LVW/BW (mg/g)假手术组 　10　 4.94±0.90　 120.9±4.1　7327±391　6958±669　2.73±0.24　2.03±0.13模型组 　 11▲　20.94±1.66*　155.7±5.1*　4520±464*　4089±361*　3.73±0.31*　2.72±0.22*黄芪甲苷低剂量组 　12　 18.89±1.72　 145.7±7.3△　4850±391　4268±582　3.54±0.41△　2.43±0.19△△黄芪甲苷中剂量组　12　 13.74±1.04△△　132.2±5.5△△　5556±793△△　5048±284△△　3.24±0.29△△　2.37±0.24△△黄芪甲苷高剂量组 　12　 11.76±1.12△△　121.1±5.8△△　6477±491△△　5546±404△△　3.03±0.37△△　2.23±0.20△△

各组大鼠心肌组织切片结果（HE染色）的比较（图1A～1E）:普通光镜下观察,假手术组中心肌细胞排列整齐、大小匀称、细胞边界清晰。模型组大鼠心肌细胞排列紊乱、肥大明显，胞间内存在大量的纤维组织，同时伴有大量炎性细胞的浸润。黄芪甲苷低、中、高剂量组心肌细胞轻度肥大，细胞排列尚整齐，伴有不同程度的纤维组织的增生，较模型组明显减轻，随着黄芪甲苷的剂量的增加，改善程度增强。

各组Masson染色结果以及CVF比较（图2A～2E）：在Masson染色中，胶原蛋白被染色为蓝色，心肌细胞染色为暗红色。与假手术组的CVF （2.16±0.35）% 相比，模型组（7.64±0.42）%的明显升高（P<0.01），与模型组CVF比值相比，黄芪甲苷低、中、高剂量组（%，6.27±0.58、5.13±0.49、4.87±0.65）明显的下降（呈现剂量的依赖性），差异均有统计学意义（P<0.01或P<0.05）。

各组大鼠CTGFmRNA表达结果比较：同假手术组（20.15±7.42）相比，模型组（97.43±6.48）中CTGFmRNA平均积分吸光度值明显增大（P<0.01）；同模型组相比，黄芪甲苷低、中、高剂量组（85.37±5.75、78.19±6.29、51.24±4.81）中CTGFmRNA的平均表达水平值显著下降，差异均有统计学意义（P<0.05）。

各组大鼠免疫组化结果的比较：CTGF主要表达于心肌胞质中（图3A～3E），表现为棕黄色的颗粒，心肌间质亦有少量的表达。同假手术组（0.09±0.03）相比，模型组（0.45±0.04）中CTGF平均积分吸光度值明显增大（P<0.01）；同模型组相比，黄芪甲苷低、中、高剂量组（0.39±0.05、0.30±0.06、0.24±0.04）中CTGF的平均积分吸光度值显著下降，差异均有统计学意义（P<0.05）。

各组大鼠Western-blot蛋白表达结果的比较（图4）：同假手术组（0.15±0.02）相比，模型组（0.57±0.06）中心肌组织CTGF因子表达水平明显增强；同模型组相比较，黄芪甲苷低、中、高剂量组（0.44±0.05、0.35±0.02、0.28±0.03）心肌组织CTGF因子表达水平明显减弱，差异均有统计学意义（P<0.01）。

图1～3　各组大鼠心肌组织检测结果（×400）

图4　各组大鼠心肌组织CTGF因子的表达的蛋白免疫印迹图

3　讨论

CHF的演变过程中，细胞凋亡、细胞肥大以及心肌纤维化是心肌重构的基本特征，其中心肌纤维化是CHF发生发展过程中的重要因素[6]。CTGF属于CCN（即刻早期反应基因）家族成员，大小为38 kD左右，可为成纤维细胞、内皮细胞、平滑肌细胞等多种细胞分泌。作为一种具有趋化性和丝裂原性的细胞因子，CTGF可以介导细胞外基质的大量合成和沉积，使成纤维细胞激活为肌成纤维细胞，促进心肌组织的纤维化，同时CTGF还可通过促进诸如金属蛋白酶组织抑制因子等蛋白酶抑制因子的表达来抑制细胞外胶原的降解，从而进一步加速CHF的进展[7]。既往研究已经证实[8-10]，CHF大鼠模型以及心肌梗死后心肌组织中的CTGF表达明显增强。

本研究采用国际上公认的腹主动脉缩窄术制作大鼠CHF模型，与假手术组相比，模型组大鼠LVEDP、LVSP显著升高（P<0.01），±dp/dt max显著的下降（P<0.01），同时达到国际CHF的指标（模型组大鼠LVEDP＞15 mmHg）。模型组中HE以及Masson染色中可见明显的纤维化，同时心肌RTPCR、免疫组化以及Western-blot证实模型组心肌组织中CTGFmRNA以及CTGF蛋白表达较假手术组显著的增多（P<0.01），进一步证实CTGF可以促进心肌纤维化生成，加速CHF的进展。

黄芪甲苷作为传统的中药制剂，既往研究已经证实黄芪甲苷具有抑制心肌肥厚[11]、抑制心肌纤维化[12，13]、增强心肌收缩力[14]、改善能量代谢[15]等一系列的作用。本研究观察黄芪甲苷不同剂量组与模型组进行比较发现，大鼠心肌组织中的CTGF在免疫组化以及Western-blot双重验证中表达都是减弱的（P<0.01或P<0.05），并呈现出剂量依赖性。CTGFmRNA的表达也是具有类似的趋势。同时心肌组织切片中，黄芪甲苷不同剂量组中的纤维化以及CVF也表现为不同程度的下降，呈现出剂量依赖性，与CTGF的表达水平相吻合。在血液动力学的监测中，黄芪甲苷高、中剂量组LVEDP、LVSP较模型组明显的下降（P<0.01或P<0.05），±dp/dt max显著的上升（P<0.01），进一步的提证实黄芪甲苷的抑制纤维化的作用。

综上所述，该研究推测黄芪甲苷能够改善CHF大鼠心脏功能，减轻心脏的纤维化程度，可能是与其抑制心肌组织CTGF的过度表达有关，并呈现剂量的依赖性。因此，该实验为黄芪甲苷治疗CHF提供的新的依据，CHF的发生发展机制错综复杂，黄芪甲苷是否还通过其他机制抑制CHF的进展尚需进一步的研究。

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（编辑：曹洪红）

收稿日期:（ 2015-08-12）

中图分类号：R541

文献标识码：A

文章编号：1000-3614（2016）02-0165-05

doi:10.3969/j.issn.1000-3614.2016.02.015

作者简介：蒋洪强 硕士研究生 主要从事慢性心力衰竭的药物治疗研究 Email:781694953@qq.com 通讯作者：张金国 Email:cck112000@aliyun.com

基金项目：山东省中医药科学技术研究项目（2013-235）；山东省高校优秀科研创新团队计划资助

目的：研究黄芪甲苷对腹主动脉缩窄术致慢性心力衰竭（CHF）大鼠心肌纤维化和结缔组织生长因子（CTGF)表达的影响。

方法：SD雄性大鼠100只，采用腹主动脉缩窄术建立CHF模型，实验分为假手术组(n=10)、模型组(n=12)和黄芪甲苷低、中、高3个剂量组（20、40、60 mg/kg, n=12），每日灌胃给药1次，连续4周。4周后监测血液动力学指标，处死大鼠后计算左心质量指数（LVMI），常规行苏木素伊红（HE）染色法观察心肌组织形态学变化，Masson染色观察心肌纤维化程度，测量心肌胶原容积分数（CVF），逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）、免疫组化和蛋白免疫印迹（Western-blot）检测CTGF mRNA以及CTGF分子表达水平。

结果：同模型组相比：黄芪甲苷低、中、高剂量组LVMI水平减弱；CVF减弱；黄芪甲苷中、高剂量组的左心室舒展末期压力下降、左心室收缩压下降，左心室内压最大变化速率上升，差异均有统计学意义（P<0.05～0.01）。病理形态学明显改善。同假手术组的CTGF平均积分吸光度值（0.09±0.03）、心肌组织CTGF因子表达水平（0.15±0.02）相比，模型组的（0.45±0.04）、（0.57±0.06）均增加；同模型组相比，黄芪甲苷低、中、高剂量组CTGF的平均积分吸光度值（0.39±0.05、0.30±0.06、0.24±0.04）和心肌组织CTGF因子表达水平（0.44±0.05、0.35±0.02、0.28±0.03）均降低，差异均有显著统计学意义（P<0.01）。

结论:黄芪甲苷能够抑制CHF大鼠的心肌纤维化和改善心功能，具体作用机制可能是通过抑制心肌组织中CTGF的过度表达来实现的。