黄芪甲苷预处理对无血清及缺氧诱导的骨髓间充质干细胞TNF-α、TGF-β1基因表达的影响

黄　灿，冼绍祥，马春涛

(1.三亚市中医院，海南 三亚 572000；2.广州中医药大学第一附属医院，广州 510405)



黄芪甲苷预处理对无血清及缺氧诱导的骨髓间充质干细胞TNF-α、TGF-β1基因表达的影响

黄灿1，冼绍祥2*，马春涛1

(1.三亚市中医院，海南 三亚 572000；2.广州中医药大学第一附属医院，广州 510405)

摘要：目的观察黄芪甲苷预处理对无血清及缺氧诱导的骨髓间充质干细胞(MSCs)凋亡相关因子的影响，并探讨其作用机制。方法采用密度梯度离心法分离培养大鼠MSCs，通过药物细胞毒性试验检测黄芪甲苷对MSCs细胞活性的影响，分别以40、80、160 μg/mL的黄芪甲苷预处理MSCs 24 h，后进行无血清及缺氧培养24 h，RT-PCR法检测细胞中TNF-α、TGF-β1的基因表达情况。结果密度梯度离心法可有效分离大鼠MSCs；各浓度黄芪甲苷对MSCs细胞活力均无影响；无血清及缺氧诱导可下调TGF-β1的基因表达；160 μg/mL黄芪甲苷组可上调TGF-β1的基因表达。结论无血清及缺氧诱导的MSCs凋亡可能是由于缺氧及生长因子匮乏的刺激所引起的，黄芪甲苷抑制无血清及缺氧诱导的MSCs凋亡的作用可能是通过提高MSCs在缺血缺氧环境下合成生长因子的能力实现的。

关键词：骨髓间充质干细胞；细胞凋亡；黄芪甲苷；生长因子

研究[1]表明，运用干细胞移植替代心肌梗死后缺血凋亡的心肌细胞，促进梗死区域心肌细胞再生及局部毛细血管网及侧支循环的形成，可使心功能得到一定程度的改善，从而被美国心脏病学会评为世界心血管领域10大研究进展之一。而MSCs在心肌梗死后的缺血和营养剥夺的病理微环境中生存率较低，大大限制了MSCs对损伤心肌的修复能力[2]。本研究早前已经证实了黄芪甲苷预处理对于无血清及缺氧诱导的MSCs凋亡具有抑制作用[3]，但不清楚其作用机制，因此继续通过对凋亡相关因子的检测，来探讨黄芪甲苷抑制MSCs凋亡的作用机制。

1材料与方法

1．1 动物SPF级SD大鼠5只,体质量120～150 g,雄性，由广州中医药大学实验动物中心提供。动物合格证号：0099253。

1．2试剂DMEM/F12培养基、胎牛血清、双抗、0．25%胰酶及胰酶替代物，GIBCO公司；黄芪甲苷，购自中国药品生物制品检定所，批号：110781-200613；Percoll分离液购自GE公司；厌氧产气袋、氧气指示剂及密封培养罐购自日本三菱瓦斯化学株式会社；CCK-8试剂盒购自日本同仁化学研究所；Trizol购自美国invitrogen公司；cDNA第一链合成试剂盒、UltraSYBR Mixture(With ROX)购自北京康为世纪科技有限公司；其他试剂，均为国产分析纯。

1．3仪器荧光倒置显微镜(日本OLYMPUS公司)；CO2培养箱(美国THERMO公司)；离心机(德国Eppendorf公司)；酶标仪(瑞士TECAN公司，型号：CENios)；Standard 96实时荧光定量PCR仪(美国Life公司，型号：ViiA7)；热循环仪(杭州晶格科学仪器有限公司，型号：K640)；台式高通量DNA合成仪(Life公司，型号：3900)；点动试管振荡器(德国IKA，型号：VORTEX1)。

1．4实验方法

1．4．1大鼠MSCs分离与培养采用密度梯度离心法分离大鼠MSCs[3]，然后以1×105/cm2接种到培养瓶内，置于37 ℃、5%CO2培养箱中进行培养。72 h之后更换完全培养基，当细胞生长至约80%融合时，用0．25%的胰酶消化细胞，进行传代培养。

1．4．2CCK法药物毒性检测将一定量的生长状态良好的MSCs消化后制成细胞悬液，以1×104个细胞/孔的密度加入96孔培养板上中间的孔中，每孔100 μL细胞悬液，培养板四周的孔中加入PBS作为空白对照，将培养板置于37 ℃、5%CO2培养箱预培养24 h。分组向各孔加入10 μL以下各组药物(黄芪甲苷40、80、160 μg/mL；0．16%DMSO工作液)，每组10个孔，另设立未加药物10个孔作为正常细胞对照孔。将培养板置于培养箱孵育24 h。向每孔加入10 μL的CCK-8溶液，继续置于培养箱内孵育1 h，用酶标仪测定在450 nm处的吸光度(以OD值表示)。

1．4．3实验分组及预处理正常对照组:用完全培养基培养，置于37 ℃、5%CO2培养箱中；无血清缺氧组：仅用完全培养基培养；黄芪甲苷组：分别用完全培养基加上40 μg/mL(0．04% DMSO)、80 μg/mL(0．08% DMSO)、160 μg/mL(0．16 % DMSO)黄芪甲苷预处理MSCs；DMSO组：用完全培养基加上最大溶媒浓度(0．16% DMSO)作为溶媒对照组预处理MSCs。除正常对照组外，余各组培养置于37℃、5%CO2培养箱中24 h，后改用无血清及缺氧培养条件模拟心肌梗死后缺血缺氧微环境：用PBS洗涤细胞2次，以去除残留的培养基，加入无血清DMEM，然后将细胞培养板、厌氧产气袋及氧气指示剂快速放入密封培养罐中，培养罐置于37 ℃、5%CO2培养箱中培养24 h。

1．4．4RT-PCR法检测TNF-α、TGF-β1的基因表达采用Trizol法提取总RNA，然后按照逆转录试剂盒说明书合成cDNA。内参GAPDH的上游引物序列为5'-CTCCCATTCCTCCACCTTTG-3’，下游引物序列为5’-CCACCACCCTGTTGCTGTAG-3’；TNF-α的上游引物序列为5’-CCACGCTCTTCTGTCTACTG-3’，下游引物序列为5’-GCTACGGGCTTGTCACTC-3’;TGF-β1的上游引物序列为5’-ATTCCTGGCGTTACCTTG-3’，下游引物序列为5’-CCCTGTATTCCGTCTCCTT-3’。然后进行PCR反应，反应条件为:95 ℃反应10 min，然后95 ℃反应15 s，60 ℃反应1 min，共40循环。溶解曲线：95 ℃反应15 s，60 ℃反应1 min，95 ℃反应15 s。阴性质控品采用灭菌双蒸水。反应结束后保存检测数据文件，分析计算出的样品Ct值。采用经典2-△△Ct法计算各样本的相对定量，进行基因表达差异的数据分析。

2结果

2．1大鼠MSCs培养原代细胞接种24 h后部分细胞逐渐贴壁，呈圆形、梭形或多角形等多种形态，培养72 h后换液，可见细胞呈集落式生长，以短梭形、星形细胞为主，后逐渐呈放射状排列，以梭形细胞为主，7 d后融合80%～90%，呈漩涡状紧密排列。经传代后细胞逐渐纯化，呈形态均一的长梭形，生长旺盛。

2．2药物毒性检测CCK-8试剂盒检测显示，细胞经40、80、160 μg/mL L黄芪甲苷及0．16% DMSO培养24 h后，所测得的OD值与正常培养的细胞所测得的OD值比较均无统计学意义(P>0．05)。

2．3RT-PCR法检测TNF-α、TGF-β1的基因表达见表1。

组 别TNF-αTGF-β1正常对照组1.45±0.305.30±0.25#无血清缺氧组1.001.00溶媒对照组1.35±0.381.27±0.12 40μg/mL黄芪甲苷组1.42±0.460.90±0.22 80μg/mL黄芪甲苷组1.29±0.181.14±0.32 160μg/mL黄芪甲苷组1.25±0.091.46±0.07#

注：与无血清缺氧组比较，#P<0.05

3讨论

3．1黄芪甲苷预处理对TNF-α的影响[4]肿瘤坏死因子-alpha(TNF-α) 主要是由活化的单核巨噬细胞分泌的一种多功能的细胞因子，主要介导免疫及炎症反应。在心肌梗死后坏死心肌局部缺血缺氧的微环境下，可引起细胞内钙超载以及氧自由基的大量释放，从而激活TNF-α、白介素-6等炎性因子，导致细胞凋亡的发生。本研究对TNF-α的基因表达进行了检测，结果显示各实验组的TNF-α基因表达水平无统计学意义，这表明无血清及缺氧诱导MSCs凋亡的过程中未引起TNF-α基因的上调，各药物组对其表达水平亦无影响，说明在无血清及缺氧诱导24 h后出现的MSCs早期凋亡不是由炎症因子的激活所引起，可能是由其他影响因素所引起的。

3．2黄芪甲苷预处理对TGF-β1的影响[5]TGF-β1广泛存在于多种生物的各种组织中，具有多重生物学效应，参与细胞生长分化、血管形成、细胞外基质形成等多种生物学过程[6]。不仅是调控MSCs增殖的主要生长因子之一，而且可抑制多种炎性介质的生物活性,同时还是一种强的免疫抑制剂，使同种异体细胞移植更为安全。

本研究通过对TGF-β1基因表达水平的检测，发现无血清缺氧组MSCs的TGF-β1基因的表达较正常对照组显著下调,说明在无血清及缺氧培养条件下,MSCs的生长因子的转录活性下降，这可能是由于缺氧及血清剥夺导致细胞生长所需的氧气及营养成分匮乏所造成的,并由此刺激MSCs出现凋亡。实验结果显示与无血清缺氧组相比，较高浓度黄芪甲苷组可显著提高无血清及缺氧培养条件下MSCs的TGF-β1基因表达；低、中浓度黄芪甲苷组及溶媒对照组的TGF-β1基因表达与无血清缺氧组无统计学意义。说明一定浓度的黄芪甲苷可以提高MSCs在缺血缺氧环境下合成生长因子的能力，并可能由此抑制由生长因子匮乏所介导的细胞凋亡。

3．3黄芪甲苷抑制细胞凋亡作用的应用前景现代药理学研究[7-11]表明，黄芪甲苷具有较好的抗凋亡作用，多项体内外研究通过对过氧化物损伤、病毒损伤、缺氧等不同诱导条件所造成的细胞凋亡的干预实验，证实了黄芪甲苷具有抑制干细胞、心肌细胞等多种细胞凋亡的作用。由此可见黄芪甲苷对于细胞凋亡的抑制作用为非特异性的，具有较为广泛的应用范围。

本研究证实了一定浓度的黄芪甲苷可提高MSCs部分生长因子的表达水平，以此推测其可能是通过改善细胞生长因子的表达来达到抑制细胞凋亡的作用。研究[12-15]认为，MSCs具有旁分泌作用，能够分泌多种细胞因子，这些因子广泛参与了减少MSCs及心肌细胞凋亡、促进心肌细胞再生、减少心肌纤维化、促进循环中的MSCs和内皮祖细胞动员和归巢到心肌梗死部位、增加缺氧心肌区域的新生血管密度、辅助细胞外基质重建等过程。黄芪甲苷可提高MSCs部分生长因子的表达水平，但其是否能够提高MSCs向微环境分泌生长因子的能力、提高缺血缺氧微环境下生长因子的含量有待进一步通过检测MSCs所处的培养液中的生长因子含量，以探索黄芪甲苷对细胞微环境的影响，这将极大地扩展其在再生医学领域的应用前景。

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[3]黄灿,冼绍祥,沈淑静.黄芪甲苷预处理抑制无血清及缺氧诱导的MSCs凋亡的研究[J].中药新药与临床药理,2013,24(3):213-217.

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Astragaloside pretreatment on gene expression of TNF-α and TGF-β1 with serum-free and hypoxia-induced MSCs

HUANG Can1,XIAN Shaoxiang2*,MA Chuntao1

(1.Sanya Hospital of Traditional Chinese Medicine,Sanya 572000,Hainan Province,China;2.The First Affiliated Hospital of Guangzhou University of Chinese Medicine,Guangzhou 510405,China)

Abstract：ObjectiveTo explore the effect and mechanism of Astragaloside on bone mesenchymal stem cells (MSCs) apoptosis induced by serum-free and hypoxia.MethodsDensity gradient centrifugation method was used to isolate and cultivate rat MSCs.Toxicity tests was used to detect the cytoactive of MSCs affected by Astragaloside.MSCs were pretreated by Astragaloside with 40 μg/mL,80 μg/mL,60 μg/mL respectively in 24 ,then cultivated in serum-free and hypoxia in 24 h.RT-PCR was used to detected the gene expression of TGF-β1 and TNF-α.ResultsMSCs were isolated effectively by using density gradient centrifugation.Astragaloside had no toxicity on MSCs viability.The induction by serum-free and hypoxia could decrease the expression of TGF-β1.The Astragaloside could increase the expression of TGF-β1.ConclusionThe apoptosis of MSCs induced by serum-free and hypoxia may be result from the absence of oxygen and growth factor.Astragaloside could inhibit MSCs apoptosis induced by serum-free and hypoxia.The possible mechanism may be Astragaloside could promote the composition of growth factor.

Keywords：bone marrow mesenchymal stem cells;poptosis;stragaloside;growth factor

(收稿日期:2015-08-28)

文章编号：2095-6258(2016)01-0025-03

中图分类号：R285.5

文献标志码：A

*通信作者：冼绍祥，电话-(0898)88275345，电子信箱-21533303@qq.com

作者简介：黄灿(1985-)，女，博士研究生，主治医师，主要从事中医药防治心血管疾病。

基金项目：国家自然科学基金资助项目(81173438)。

DOI:10.13463/j.cnki.cczyy.2016.01.008