慢性癫痫大鼠心肌中钙敏感受体及丝裂原活性蛋白激酶表达的改变*

郭 津， 刘 阳,4， 王 超， 白玲玲， 韩小唯， 张鑫阳， 孙艳秋， 王鲁川△， 姜志梅，3△

(1. 佳木斯大学附属第三医院， 2. 佳木斯大学附属第一医院， 黑龙江 佳木斯 154002； 3. 哈尔滨医科大学公共卫生学院， 4. 哈尔滨市第四医院， 黑龙江 哈尔滨 150026)

慢性癫痫大鼠心肌中钙敏感受体及丝裂原活性蛋白激酶表达的改变*

郭 津1， 刘 阳1,4， 王 超2， 白玲玲1， 韩小唯2， 张鑫阳1， 孙艳秋1， 王鲁川2△， 姜志梅1，3△

(1. 佳木斯大学附属第三医院， 2. 佳木斯大学附属第一医院， 黑龙江 佳木斯 154002； 3. 哈尔滨医科大学公共卫生学院， 4. 哈尔滨市第四医院， 黑龙江 哈尔滨 150026)

目的：观察钙敏感受体在癫痫大鼠心肌细胞中的表达和丝裂原活化蛋白激酶途径的变化。方法：戊四氮成功点燃慢性癫痫模型；Wistar健康雄性大鼠随机分为5组：对照组；癫痫组；癫痫+精胺组；癫痫+精胺+Chalhex231组；癫痫+Chalhex231组，每组各12只。模型组用PTZ亚惊厥剂量(35 mg/kg)持续腹腔注射28 d后停药1周，再用相同剂量的PTZ测试，对照组以等容生理盐水代替PTZ 腹腔注射，依据Racine行为学分级标准出现连续5次出现Ⅱ级以上发作者视为成功点燃慢性癫痫模型；以钙敏感受体激动剂精胺，钙敏感受体抑制剂Chalhex231做为干预因素，(精胺3 μmol/L和Chalhex231 2 μmol/L)；检测血清肌酸激酶、肌酸激酶同工酶；检测心肌功能、大鼠心肌组织形态学变化、心肌细胞的超微结构、心肌中钙敏感受体以及细胞外调节蛋白激酶 ERK、 p-ERK、p-JNK表达情况。结果：与正常组比较，癫痫组CK、CK-MB含量明显升高，心脏超声显示心脏顺应性下降，左室功能降低，E/A<1。心肌细胞超微结构显示损伤严重。CaSR表达进一步增加，p-JNK蛋白表达增加，p-ERK蛋白表达减少。精胺能够促进癫痫所诱发的CaSR蛋白表达增多、p-JNK蛋白表达增加，p-ERK蛋白表达减少；Chalhex231的作用相反。结论：慢性癫痫可诱发心肌改变，CaSR表达增多可能参与癫痫慢性发作时心肌损伤，MAPK信号通路可能参与慢性癫痫心肌损伤过程。

钙敏感受体；丝裂原活化蛋白激酶；癫痫；心肌；大鼠

癫痫是一种常见的以反复突然发作的意识丧失伴抽搐为主要症状的慢性神经系统疾病，全世界有超过五千万的癫痫患者[1,2]，其中10%～15%的癫痫突发死亡为不明原因的猝死[3]。国内外学者研究认为,癫痫不明原因的猝死可能与癫痫频繁发作导致的呼吸与循环功能紊乱有关。癫痫发作时,患者常出现心率改变,甚至心律失常、心脏骤停等,这种由脑部病变引起的心脏损伤称为脑心综合征。自1954年Bruch首次报道脑心综合征以来，其逐渐为大家所认识。但是临床尚未将脑心综合征发病机制完全阐明，多认为关联于脑损伤后体液调节障碍、血流动力学改变以及血管病变等[4]。钙敏感受体(calcium-sensing receptor, CaSR)是G蛋白偶联受体超家族中C家族成员，主要功能为维持机体钙与其他金属离子的稳定状态，参与基因表达，调节激素分泌，激活离子通道，细胞分化与凋亡以及衰老等过程[5,6]。丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated proteinkinase, MAPK)是广泛存在于真核细胞中的一类丝/苏氨酸蛋白激酶。在哺乳动物中，MAPK 可以被物理应激、细胞因子和细菌复合物等细胞外信号或刺激激活，并将这些刺激信号通过三级激酶级联反应的方式传递到细胞核中，进而调节细胞增殖、分化、转化、侵袭、凋亡等生物学效应[7]。本课题组曾用戊四氮(pentetrazole, PTZ)复制大鼠癫痫发作模型可引起大鼠脑组织CaSR表达增加和细胞凋亡，其机制与氧化应激和细胞凋亡可能也参与癫痫的发作[8]。癫痫是脑部疾患的一种，本研究将从脑心综合症的角度出发，观察CaSR在癫痫大鼠心肌细胞中的表达和MAPK途径的变化。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

成年雄性清洁级Wistar大鼠，体重(180±10) g(哈尔滨医科大学动物实验室)；RIPA裂解液(索莱宝科技有限公司)；Anti-CaSR,Anti-p-ERK,Anti-p-JNK,Anti-p-P38(Cell Signaling Technology,USA)； 电泳仪JY600C(北京六一电泳设备有限公司)；H-600A型透射电镜(日立)；视频脑电(EMS 奥地利)；超声(飞利浦 德国)。

1.2 分组及模型制作

健康成年雄性Wistar大鼠，随机分为5组(n=12)：(1)正常组(C)：每天腹腔注射生理盐水，剂量等同PTZ，连续28 d；(2)癫痫组(EP)：每天腹腔注射PTZ(35 mg/kg)1次，连续28 d，停药7 d，再用同剂量注射一次；配制方法：将戊四氮溶解在0.9%生理盐水中，戊四氮的浓度为20 mg/ml。注射后记录癫痫发作的级别、发作持续时间 (s)及发作潜伏期(即注入PTZ 到首次痫性发作之间经历的时间)，出现Ⅲ级以上发作的大鼠视为模型制备成功[9]。(3) EP+精胺(CaSR激动剂)：同2组，停药7 d里每天尾静脉注射精胺(3 μmol/L)一次；(4) EP+Calhex231+精胺：同2组，停药7 d里每天尾静脉注射Calhex231(2 μmol/L)和精胺(3 μmol/L)各1次；(5) EP+ Calhex231(CaSR抑制剂)：同2组，停药7 d里每天尾静脉注射Calhex231(2 μmol/L)1次。

1.3 大鼠心脏超声心动图检查

腹腔水合氯醛 (剂量为350 mg/kg) 腹腔麻醉,仰卧位固定麻醉的大鼠后,胸部备皮,应用线阵探头，选择探头频率为7.0 MHz，对大鼠心脏行超声检查。探头置于大鼠左胸,首先在胸骨旁左心室短轴取得满意的二维图像后,然后将M型取样线在乳头肌水平，垂直于室间隔和左心室后壁获取大鼠心脏M型超声心动图。

1.4 大鼠心肌酶学检测

将麻醉后大鼠, 取眼球血2 ml, 3 000 r/min 4℃离心10 min,取上层血清, 按照试剂盒说明严格操作, 分别检测肌酸激酶(phosphocreatine kinase，CK)、肌酸激酶同工酶(MB isoenzyme of creatine kinase，CK-MB)的活性。

1.5 心肌组织形态学的光镜观察

于大鼠心尖部切取1 mm×1 mm×1 mm心室组织，4%多聚甲醛磷酸缓冲溶液固定24～48 h。常规脱水、浸蜡、包埋、染色、透明和封片, 制作成普通的HE染色切片。用日本产Nikon ECLIPSE显微图像分析系统E100进行光学显微镜观察。

1.6 心肌超微结构的透射电镜观察

切取两组大鼠心尖区心肌,进一步切成约1 mm×1 mm×1 mm大小的组织块, 用2.5%戊二醛前固定, 1%锇酸进行后固定, 然后用丙酮逐级的脱水,再用环氧树脂包埋, 超薄切片, 最后1%醋酸双氧铀和枸橼酸铅双重染色, 然后应用H-600A型透射电镜(日立)观察。

1.7 Western blot检测心肌细胞CaSR、ERK、p-ERK、p-JNK蛋白表达水平

取20 μg蛋白，用电泳仪JY600C进行10% SDS-PAGE电泳，然后用100 V电压转印至硝酸纤维素膜(PVDF膜)上1 h。将该膜放在含5%脱脂牛奶的封闭液中封闭，37℃ 1 h；用封闭液稀释一抗，4℃震荡过夜。反复洗膜，将膜在碱性磷酸酶标记的抗IgG (1∶1 000)中孵育，室温轻摇1 h，洗膜，用Western blot检测心肌细胞CaSR、细胞外信号调节激酶(extracellular-signal regulatedproteinkinas， ERK),(proteaseextracellular -signal regulatedproteinkinase，p-ERK)、(protease c -Jun amino -terminal kinase，p-JNK)蛋白表达水平。

1.8 统计学处理

2 结果

2.1 脑电图的变化

对照组大鼠脑电图以α、β波为主，散在θ波，无异常放电表现。癫痫组大鼠脑电图表现为，阵发性高幅尖波，棘波、棘慢复合波(图1)。

Fig. 1 The EEG findings from different groups A: Control; B: Epilepsy

2.2 心脏超声心动图检查的结果

与正常大鼠超声心动图比较，慢性癫痫组大鼠左室功能下降，左心室射血分数(left ventricular enjection fraction,LVEF)和左心室短轴缩短分数(fractional shortening,FS),均降低，E/A<1。各组大鼠心脏超声心动图变化情况见图2。

Fig. 2 The echocardiography findings from different groups A: Control; B: Epilepsy

2.3 两组大鼠心肌酶学检测的结果

与对照组比较，癫痫组大鼠血肌酸激酶(CK)和肌酸激酶同工酶(CK-MB)含量均增高(P<0.05，表1)。

GroupCK CK⁃MB Control827±83466±46Epilepsy2035±202∗672±67∗

CK： Phosphocreatine kinase； CK-MB： Creatine phosphokinase-isoenzyme-MB

*P<0.05vscontrol

2.4 两组大鼠心肌组织形态学光镜观察的结果

HE染色光镜400倍视野下所见: 正常对照组心肌细胞，肌丝排列整齐, 横纹和细胞核清晰;癫痫组心肌细胞，肌丝排列紊乱，横纹模糊, 部分胞浆消失溶解(图3)。

Fig. 3 Morphological observation of rat myocardial cells under light microscope (HE ×400) A: Control; B: Epilepsy

2.5 两组大鼠心肌超微结构透射电镜观察的结果

透射电镜下见：对照组心肌细胞肌丝排列得整齐, 闰盘和横纹结构清晰, 细胞核和线粒体结构完整；癫痫组心肌细胞肌束间出现水肿，肌丝片状溶解断裂，线粒体肿胀、嵴溶解融合或有电子致密物沉积，空泡现象(图4)。

Fig. 4 The ultrastructural alteration of cardiac tissues under electron microscope (×8 k) A: Control; B: Epilepsy

2.6 五组大鼠心肌细胞CaSR、ERK、p-ERK、p-JNK蛋白表达水平的变化

癫痫组大鼠心肌细胞的CaSR,ERK,p-ERK,p-JNK蛋白表达变化与正常组比较。CaSR表达增高(P<0.05)。ERK表达减少(P<0.05), p-JNK表达增高(P<0.05)而p-ERK表达无明显变化(P>0.05，图5-7)。

Fig. 5 Western blot analysis for CaSR in rat cardiac tissue of different groups. The protein changes values in represents group(n=6) A: Control group； B: Epilepsy； C: Epilepsy+spermine group； D: Epilepsy+spermine+Chalhex231group； E: Epilepsy+Chalhex231group*P<0.05vscontrol group;?#P<0.05vsepilepsy group

Fig. 6 Western blot analysis for p-JNK in rat cardiac tissue of different groups. The proteins change values in represents group(n=6) A: Control group； B: Epilepsy； C: Epilepsy+spermine group； D: Epilepsy+spermine+Chalhex231group； E: Epilepsy+Chalhex231group*P<0.05vscontrol group;?#P<0.05vsepilepsy group

3 讨论

癫痫是人类一大顽疾，但癫痫是否引起心脏损伤，具体损伤机制如何仍不清楚。目前癫痫模型中以点燃模型应用最为广泛，认为其机制与人类癫痫发病机制相类似[10]。PTZ 点燃不仅可以提高发作的易感性，还可以导致脑部功能的改变，目前认为PTZ 点燃癫痫模型为难治性癫痫较为理想的模型[11]。介于以上原因，本实验采用了腹腔内注射PTZ 的方法制作慢性癫痫模型。脑电图表现的痫性发放和临床发作是判断癫痫发作的两个主要特征。本实验采取临床观察与脑电图监测，其结果显示大鼠慢性癫痫模型制作成功。

Fig. 7 Western blot analysis for ERK in rat cardiac tissue of different groups. The protein changes values in represents group(n=6) A: Control group； B: Epilepsy； C: Epilepsy+spermine group； D: Epilepsy+spermine+Chalhex231group； E: Epilepsy+Chalhex231group*P<0.05vscontrol group;?#P<0.05vsepilepsy group

采用超声心动图和血清心肌酶检测。超声心动图观察到模型组左室顺应性减低，射血分数降低，心肌酶学检查中模型组CK,CK-MB升高，其中的CK-MB被认为能够特异性地反映心肌受损。综上所述，故可推断，在慢性癫痫发病过程中存在着心脏功能与心肌的受损。

采用HE染色和透射电镜观察。HE染色发现模型组与对照组相比心肌形态发生改变，出现肌丝排列紊乱，横纹模糊，部分胞浆消失溶解；透射电镜下模型组表现心肌细胞肌束间出现水肿，肌丝片状溶解断裂，线粒体肿胀、嵴溶解融合，空泡现象。从形态学角度均能说明慢性癫痫发病中心肌细胞发生损伤。

从病理生理角度分析，癫痫发病过程中心肌损伤可能与以下因素有关：癫痫发作时，脑电冲动异常增加，导致交感和副交感神经失衡，影响心脏传导系统和心肌的复极化,造成心脏损伤，癫痫发作时，机体处于应激状态，交感-肾上腺系统释放大量儿茶酚胺、去甲肾上腺素，导致冠状动脉痉挛或收缩，造成心肌缺血性损伤。

众多实验已表明，CaSR表达增多时心肌损伤较重,并已有文献证实CaSR通过G蛋白-PLCIP3通路引起细胞内钙增加，参与心肌钙稳态的调控，是细胞钙超载的发生机制之一[12,13]。本实验通过免疫蛋白印记法证实在慢性癫痫大鼠模型中，CaSR表达增加(P<0.05)。说明钙敏感受体的增加可能参与了慢性癫痫心肌的损伤过程。

近年来，在分子生物学和遗传学方面，已经对凋亡的效应和调节机制特别针对信号转导途径进行深入的研究，其中酪氨酸激酶介导的转导通路MAPK通路在CaSR信号转导中的作用开始受到人们重视。目前在哺乳动物细胞中已鉴定4条MAPK信号转导通路，本实验选取其中两条通路即ERK通路和JNK通路。磷酸化的ERK和JNK为其活性状态。在大多数情况下，ERK发挥细胞保护作用，而JNK表现为促凋亡作用[14]。这与本实验采用Western bolt技术所得出结果相吻合，ERK的表达减少(P<0.05), p-JNK表达增加(P<0.05),说明ERK通路和JNK通路参与慢性癫痫心肌损伤的过程。运用CaSR激动剂和阻断剂，进一步证实 CaSR的表达增加通过分别激活MAPK信号转导通路中的ERK通路保护心肌细胞和JNK通路促进心肌细胞凋亡。实验中发现p-ERK表达无显著变化，可能因为磷酸化的蛋白在试验操作过程中发生去磷酸化，而影响实验结果。其结果有待进一步验证。

本实验通过PTZ点燃慢性癫痫大鼠模型，观察到CaSR参与大鼠癫痫发作时心肌损伤和心肌细胞凋亡，并揭示CaSR的表达增多可分别使ERK通路和JNK通路中的ERK磷酸化减少和JNK磷酸化增加，进而表现出相应保护心肌细胞和促进心肌细胞的凋亡的作用。这对癫痫引起的心肌损伤机制研究有一定的意义，并为临床治疗癫痫引起的心肌损伤提供新的视角。

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The expression of calcium sensing receptor(CaSR) and MAPK pathway changes in myocardial cells of epilepsy rats

GUO Jin1， LIU Yang1,4， WANG Chao2， BAI Ling-ling1， HAN Xiao-wei2， ZHANG Xin-yang1， SUN Yan-qiu1， WANG Lu-chuan2， JIANG Zhi-mei1，3△

(1. The Affiliated the Third Hospital, 2. The Affiliated the First Hospital Jiamusi University, Jiamusi 154002； 3. Harebin Medical College of Public Health, 4.Harebin NO.4 Hospital, Harebin 150026, China)

Objective: To investigate the changes of the myocardial cells in chronic epileptic rat model and to observe the expression of calcium sensing receptor(CaSR) and mitogen-activated proteinkinase(MAPK)pathway changes in epilepsy rats. Methods: The chronic epileptic rat model was induced by pentetrazole (PTZ). Adult male Wistar rats were divided into 5 groups randomly, and there were 12 rats in each group. The rats in model group were treated with a sub-convulsive dose of PTZ (35 mg/kg) by intraperitoneal injection for 28 d. After stopping a week, the same dose of PTZ test was conducted. The control group was treated with isovolumetric saline instead of PTZ by intraperitoneal injection. According to Racine behavior grading standards the rat emerged two levels above epileptic seizure 5 consecutive times, which was considered the chronic epilepsy model successful ignition. The intervention factors included spermine(calcium-sensing receptor agonist， 3 μmol/L) and Chalhex231(calcium-sensing receptor inhibitor， 2 μmol/L). The serum creatine kinase (CK) and creatine kinase isoenzyme(CK-MB)were detected. The cardiac functions, morphological changes of rat myocardial tissue, myocardial cell ultrastructure, myocardial cell calcium sensing receptor and extracellular regulated protein kinase (ERK), p-ERK, p-JNK expression were carried out. Results： Compared with normal control group, CK, CK-MB in PTZ group were increased obviously. The cardiac compliance and left ventricular function were decreased, E/A<1 by echocardiography. The myocardial ultrastructure showed serious injury. The expressions of CaSR and p-JNK were increased, but the expression of p-ERK was decreased. Spermine could promote the expressions of CaSR and p-JNK, and decrease the expression of p-ERK in epilepsy; however, the role of Chalhex231 was opposite. Conclusion: The level of CaSR expression increased in chronic epileptic rat model. CaSR activated the expressions of MAPK of the myocardial cells,and then influenced the cardiac myocyte apoptosis.

calcium-sensing receptor; mitogen-activated proteinkinase; epilepsy; myocardial cells

国家自然科学基金资助项目(81300122)；黑龙江省青年科学基金项目(QC2016130)；佳木斯大学校级创新团队(Cxtd201302)

2015-04-14

2016-04-19

R363

A

1000-6834(2016)05-454-05

10.13459/j.cnki.cjap.2016.05.018

△【通讯作者】Tel： 13846163601； E-mail： mynard93@163.com