TNFRSF4基因 rs17568多态性与2型糖尿病的相关性*

乔　彦，谢席胜，刘　瑞，何明海

1.南充市中心医院 内分泌科(南充　637000)；2.南充市中心医院 肾内科(南充　637000)；3.四川大学华西医院 人类疾病相关多肽研究室 (成都　610041)



TNFRSF4基因 rs17568多态性与2型糖尿病的相关性*

乔彦1，谢席胜2△，刘瑞3，何明海1

1.南充市中心医院 内分泌科(南充637000)；2.南充市中心医院 肾内科(南充637000)；3.四川大学华西医院 人类疾病相关多肽研究室 (成都610041)

【摘要】目的探讨四川南充地区汉族人TNFRSF4基因 rs17568多态性与2型糖尿病(T2DM)的相关性。方法应用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性技术检测186例健康体检者和220例T2DM患者rs17568多态性。酶法测定血糖(Glu)、血清甘油三酯(TG)、总胆固醇(TC)及高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)。结果 TNFRSF4基因 rs17568位点等位基因频率和基因型频率分布均符合Hardy-Weinberg 平衡定律。rs17568多态位点G等位基因频率为28.2%。两组rs17568位点G等位基因的频率差异无统计学意义(P>0.05)。rs17568 多态位点在T2DM组和对照组中，GG、AG基因型携带者血清HDL-C水平较AA基因型携带者明显升高(P<0.05)。结论TNFRSF4基因 rs17568多态性与T2DM无关联，但其G等位基因与血清HDL-C水平密切相关。

【关键词】TNFRSF4；2型糖尿病；遗传多态性

糖尿病是威胁人类健康最重要的慢性疾病之一，是由遗传和环境因素共同作用而成的多基因遗传性复杂病。心脑血管疾病是2型糖尿病(T2DM)患者致死致残的主要原因，T2DM是心肌梗死、脑梗死等动脉粥样硬化疾病的独立危险因素。

目前，研究[1-3]认为，动脉粥样硬化是一种慢性炎症性疾病，炎症反应参与动脉粥样硬化的发生、发展及斑块破裂、血栓形成的全过程。T细胞激活是动脉粥样硬化重要的炎性致病因素之一[4]。TNFRSF4(OX40,CD134)及其配体TNFSF4(OX40L,CD134L)作为免疫应答过程中重要的协同刺激分子，可促进T细胞的增殖和分化，同时调节巨噬细胞的抗原呈递功能，影响动脉粥样硬化进程[5]。最新研究[6]显示，TNFRSF4基因所在区域，与小鼠的1个动脉粥样硬化数量性位点邻近，与心肌梗死及动脉粥样硬化密切相关。糖尿病是一种细胞免疫性疾病[7-8]，目前尚未见TNFRSF4/TNFSF4这一参与免疫反应的信号通路与T2DM的相关性研究。本研究旨在探讨四川南充地区汉族人TNFRSF4基因rs17568位点的基因频率分布及其与T2DM的相关性，为探讨中国汉族人T2DM发病的分子遗传基础提供依据。

1资料与方法

1.1临床资料

选取2014年7月至2015年6月于南充市中心医院就诊的220例新诊断的T2DM患者，符合1999年世界卫生组织诊断标准：典型糖尿病症状(多饮、多尿、多食、体质量下降)加上随机血糖(Glu)≥11.1 mmol/L， 或加上空腹血糖(FBG)≥7.0 mmol/L， 或加上葡萄糖负荷后2 h血糖(PBG)≥11.1 mmol/L。糖尿病病程少于1年，经药物治疗后糖化血红蛋白(HbA1c)<6.5%。其中，男136例， 女84例，年龄(51.3±12.5)岁。排除1型糖尿病、其他特殊类型糖尿病、妊娠糖尿病、糖尿病急性并发症、感染、应激、高血压病、严重高脂血症及心、肺、肝、肾等主要脏器严重疾患者，入选者均为汉族。同时，随机选取无血缘关系的健康体检者186例， 均为汉族。其中，男119例，女67例，年龄(52.1±14.2)岁。经询问病史和体检，排除心、肺、肝、肾及内分泌疾病等。所有受试对象均签署知情同意书。

1.2方法

1.2.1血液基因组DNA的分离及聚合酶链反应 抽取空腹12～14 h 静脉血1 mL，EDTA 抗凝。按Erlich[9]微量DNA 全血提取法提取基因组DNA，-20 ℃保存备用。PCR扩增引物由北京百泰克公司合成。引物1为 5′-CCA GCC ACG CAG CCC CAG AA -3′，引物2为 5′-CTG GGT GGG GTC CAC AGG AGG G-3′。

PCR反应总体积25 μL，含0.5 μmol/L 引物，200 μmol/ L dNTP，25 mmol/L MgCl2，0.2 μg DNA 模板，2.0 U Taq DNA 聚合酶。反应在DNA热循环仪上进行，PCR反应条件：94 ℃预变性5 min； 94 ℃变性30 s，67 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，循环35次；72 ℃延伸5 min，结束反应。用2%的琼脂糖凝胶进行电泳，检测特异性PCR扩增产物。

1.2.2PCR扩增产物的酶切鉴定取10 μLPCR扩增产物，加入10 U 限制性内切酶Mbo II，37 ℃保温4 h。酶切产物加入10% 聚丙烯酰胺凝胶(PAGE)样品槽中，在TBE缓冲液中，100 V电压电泳90 min，EB染色后于Bio-Rad凝胶成像系统拍照并记录结果。

1.2.3突变序列测定随机挑选部分PCR扩增产物送北京三博远志生物技术有限公司进行DNA 序列测定。

1.2.4血脂及载脂蛋白的测定Glu、血清甘油三酯(TG)、总胆固醇(TC)及高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)按酶法测定。低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C) 按公式 (TG<4.52 mmol/L) 计算：LDL-C=TC-(TG/2.1+HDL-C)。

1.3统计学方法

2结果

2.1T2DM组和对照组临床及生化资料

T2DM组和对照组年龄、性别构成基本一致。与对照组比较，T2DM组的Glu、TG、LDL-C水平升高，而HDL-C水平则降低，差异有统计学意义(P<0.05)；血清TC和体质量指数(BMI)差异无统计学意义(P>0.05)(表1)。

2.2TNFRSF4基因 rs17568 SNP 位点多态性分析

PCR扩增片段大小为213 bp，用限制性内切酶Mbo II消化后，在PAGE电泳谱上显示3种基因型：GG纯合子存在Mbo II酶切位点，显示183、30 bp；AA纯合子Mbo II酶切位点消失，显示213 bp；AG杂合子显示213、183、30 bp。因30 bp 的片段太短，电泳后不能在凝胶上显示，但不影响基因型的判读。对3种基因型进行DNA 序列测定，测序图谱如图2，箭头所指处为碱基突变位点，测序结果与PCR-RFLP结果一致(图1)。

图1rs17568多态位点酶切电泳图

注：M：DNA相对分子质量标准；1，2，4： 基因型AA；3：基因型GG；5，6：基因型AG

2.3T2DM组与对照组rs17568基因型及等位基因频率的比较

T2DM组和对照组的 TNFRSF4基因rs17568多态性基因型分布均符合Hardy-Weinberg遗传平衡定律。rs17568等位基因分布在两组均以A等位基因为常见等位基因，G等位基因为少见等位基因。rs17568多态位点G等位基因频率为28.2%，等位基因A、G的频率在T2DM 组和对照组分别为71.4%、28.6%和72.3%、27.7%。两组间基因型频率和等位基因频率分布差异无统计学意义(P>0.05)(表2)。

2.4TNFRSF4基因 rs17568 多态性不同基因型亚组Glu及血脂水平的比较

T2DM组和对照组TNFRSF4基因rs17568 多态位点血清HDL-C水平在G等位基因携带者GG、AG基因型较AA等位基因携带者增高，差异有统计学意义(P<0.05)。rs17568 多态位点不同基因亚组Glu、TG、TC、LDL-C差异无统计学意义(P>0.05)(表3)。

注：与基因型AA亚组比较，*P<0.05

3讨论

TNFRSF4(OX40)是肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor，TNF)受体超家族成员之一，基因位于染色体1p36，为Ⅰ型跨膜糖蛋白，定位于活化的CD4+ 和CD8+ T淋巴细胞表面，主要表达于CD4+T细胞表面，与配体TNFSF4(OX40L)参与T 细胞的活化、增殖和迁移[10]，影响动脉粥样硬化的形成和发展，在免疫应答中发挥极其重要的作用。研究[11]表明，TNFRSF4主要表达在炎性浸润部位的T细胞上，而非炎性浸润部位几乎没有表达。Foks等[12]在LDL受体缺陷的小鼠实验研究中发现，阻断OX40/OX40L信号通路，会导致动脉粥样硬化的复发。研究[13]发现，与正常人相比，1型糖尿病患儿CD4+免疫细胞表达更高水平的OX40。有研究[14]表明，OX40/OX40L信号通路可能为糖尿病患者器官移植保护提供新治疗靶点。但TNFRSF4基因SNP与中国汉族T2DM的相关性研究目前尚无研究。

本研究对四川南充地区406名汉族人OX40基因rs17568 多态位点基因型分析显示，rs17568多态位点G等位基因的频率为28.2%，与日本人的25%[15]及瑞典人的23%[16]接近，未显示rs17568基因频率存在明显的种族差异性。T2DM组和对照组rs17568多态位点A、G等位基因频率分别71.4%、28.6%和72.3%、27.7%，两位点基因型频率和等位基因频率在T2DM组和对照组之间的分布差异均无统计学意义(P>0.05)，提示rs17568 多态位点与T2DM间没有直接关联。

进一步研究发现，TNFRSF4基因rs17568 多态位点G等位基因携带者的血清HDL-C水平高于非G等位基因携带者，差异有统计学意义(P<0.05)，这一相关性在正常人群和T2DM患者中同时存在。对瑞典健康人群的研究[16]发现，rs17568常见G等位基因携带者反而出现低水平的HDL-C，但没有发现其与其他血脂及脂蛋白有相关性，提示不同种族间基因多态性可能对血脂存在不同作用。Ria等[16]对OX40进行基因测序分析发现，其序列高度保守，只有rs17568位于编码区，但这一变异并没有引起相应氨基酸改变，而G等位基因分布频率在心梗的病人组要低于对照组。同时发现，rs17568与一相邻基因的多态性有强的连锁不平衡性。rs17568与HDL-C的相关性，是由与其连锁不平衡的多态位点决定还是其他原因，有待更深的研究，但目前不能推论这一相关性与T2DM有关。

参考文献

[1]Libby P,Ridker PM,Hansson GK.Progress and challenges in translating the biology of atherosclerosis[J].Nature,2011,473(7347):317-325.

[2]Fujii S.Atherosclerosis,Chronic Inflammation,and Thrombosis: In Search of the Missing Link in Laboratory Medicine[J].Rinsho Byori,2015,63(5):605-611.

[3]Profumo E,Buttari B,Tosti ME,etal.Plaque-infiltrating T lymphocytes in patients with carotid atherosclerosis: an insight into the cellular mechanisms associated to plaque destabilization[J].J Cardiovasc Surg (Torino),2013,54(3):349-357.

[4]Foks AC,Lichtman AH,Kuiper J.Treating atherosclerosis with regulatory T cells[J].Arterioscler Thromb Vasc Biol,2015,35(2):280-287.

[5]Sugamura K,Ishii N,Weinberg AD.Therapeutic targeting of the effector T-cell co-stimulatory molecule OX40[J].Nat Rev Immunol,2004,4(6):420-431.

[6]Wang X,Ria M,Kelmenson PM,etal.Positional identification of TNFSF4,encoding OX40 ligand,as a gene that influences atherosclerosis susceptibility[J].Nat Genet,2005,37(4):365-372.

[7]Luczyński W,Wawrusiewicz-Kurylonek N,Szypowska A,etal.Generation of T regulatory cells in children with type 1 diabetes mellitus[J].Pediatr Endocrinol Diabetes Metab,2011,17(2):64-70.

[8]Kizilay Mancini O,Shum-Tim D,Stochaj U,etal.Age,atherosclerosis and type 2 diabetes reduce human mesenchymal stromal cell-mediated T-cell suppression[J].Stem Cell Res Ther,2015,6:140.

[9]Lynch J.PCR Technology:Principles and Applications for DNA Amplification[J].Journal of Medical Genetics,1990,36(8):536.

[10] Croft M.Co-stimulatory members of the TNFR family: keys to effective T-cell immunity[J].Nat Rev Immunol,2003,3(8):609-620.

[11] Ito T.TSLP-activated dendritic cells induce an inflammatory T helper type 2 cell response through OX40 ligand[J].Journal of Experimental Medicine,2005(9):1213-1223.

[12] Foks AC,van Puijvelde GH,Bot I,etal.Interruption of the OX40-OX40 ligand pathway in LDL receptor-deficient mice causes regression of atherosclerosis[J].J Immunol,2013,191(9):4573-4580.

[13] Szypowska A,Stelmaszczyk-Emmel A,Demkow U,etal.High expression of OX40 (CD134) and 4-1BB (CD137) molecules on CD4(+)CD25(high) cells in children with type 1 diabetes[J].Adv Med Sci,2014,59(1):39-43.

[14] Honkanen-Scott M,Johnson J,Hering B,etal.Blockade of OX40 signals enhance survival of xenoislet grafts in spontaneously diabetic NOD mice[J].Transplant Proc,2008,40(2):483-485.

[15] Mashimo Y,Suzuki Y,Hatori K,etal.Association of TNFRSF4 gene polymorphisms with essential hypertension[J].J Hypertens,2008,26(5):902-913.

[16] Ria M,Eriksson P,Boquist S,etal.Human genetic evidence that OX40 is implicated in myocardial infarction[J].Biochem Biophys Res Commun,2006,339(3):1001-1006.

Analysis of TNFRSF4 gene rs17568 Polymorphisms in Patients with Type 2 Diabetes Mellitus

QiaoYan1,XieXisheng2△,LiuRui3,HeMinghai1.

1.DepartmentofEndocrinology,NanchongCentralHospital,Nanchong637000,China;2.DepartmentofNephrology,NanchongCentralHospital,Nanchong637000,China; 3.DivisionofPeptidesRelatedwithHumanDiseases,WestChinaHospitalofSichuanUniversity,Chengdu610041,China

【Key words】TNFRSF4; Type 2 diabetes mellitus; Gene polymorphism

【Abstract】ObjectiveTo investigate the rs17568 polymorphisms of TNFRSF4 gene and their correlation with type 2 diabetes mellitus among people of Han race in the Nanchong area of Sichuan Province. MethodsThe genotypes and allele frequencies of rs17568 polymorphisms were assayed by polymerase chain reaction and restriction fragment length polymorphism (PCR-RFLP) among 186 healthy subjects and 220 type 2 diabetes mellitus (T2DM) patients. Then the enzymatic kits were used to assay their serum glucose (Glu), serum triglycerides (TG), total cholesterol (TC) and high density lipoprotein cholesterol (HDL-C). ResultsThe allele and genotype frequencies at rs17568 site were in accordance with Hardy-Weinberg equilibrium principle. The frequencies of G allele at rs17568 site were 0.286 and 0.276 in the T2DM group and the control group respectively and there was no significant difference in allele and genotypes frequencies between the two groups (P>0.05). Subjects with genotype GG and AG at rs17568 sites had a higher serum concentration of HDL-C than those with genotype AA in both groups (P<0.05). ConclusionThe rs17568 polymorphisms in the TNFRSF4 gene are not correlated with type 2 diabetes mellitus, but the G allele at rs17568 site is correlated with serum high density lipoprotein cholesterol among people of Han race.

doi:10.3969/j.issn.1674-2257.2016.03.008

*基金项目：四川省卫生厅资助项目(No:120283)

通信作者：△谢席胜，E-mail:xishengx@163.com

【中图分类号】R587.1

【文献标志码】A

网络出版地址:http://www.cnki.net/kcms/detail/51.1705.R.20160613.1053.016.html

·论著·