二甲双胍对人子宫内膜癌细胞增殖的影响及其机制

王梦莹，秦淑兰，赖晓阳

(南昌大学第二附属医院，南昌330006)



二甲双胍对人子宫内膜癌细胞增殖的影响及其机制

王梦莹，秦淑兰，赖晓阳

(南昌大学第二附属医院，南昌330006)

摘要：目的探讨二甲双胍对人子宫内膜癌细胞系Ishikawa 细胞增殖的影响及可能的作用机制。方法 以不同浓度(0、1、5、10 mmol/L)的二甲双胍作用于Ishikawa 细胞分别干预24、48、72 h，采用MTT法检测细胞增殖率；干预48 h后，采用RT-PCR技术检测雷帕霉素靶蛋白(mTOR)和DNA损伤反应调节基因(REDD1)mRNA的表达，Western blotting技术检测mTOR和REDD1蛋白的表达。结果二甲双胍抑制子宫内膜癌Ishikawa细胞增殖，呈浓度时间依赖性(P均<0.05)。二甲双胍增加REDD1蛋白及基因的表达，降低mTOR蛋白及基因的表达(P均<0.05)。结论 二甲双胍可能通过REDD1/mTOR信号通路抑制子宫内膜癌Ishikawa细胞增殖。

关键词：子宫肿瘤；二甲双胍；雷帕霉素靶蛋白；DNA损伤反应调节基因；细胞增殖

子宫内膜癌是发生于子宫内膜的一组上皮性恶性肿瘤，好发于围绝经期和绝经后女性。在我国，子宫内膜癌的发病率逐年上升,并且呈年轻化趋势,居女性生殖系统恶性肿瘤的第2位。目前流行病学证据表明，肿瘤的发生率与糖尿病以及某一特定糖尿病风险因素、糖尿病治疗有关[1]。二甲双胍作为治疗糖尿病的一线药物，具有抗肿瘤的多种生物活性，目前受到人们的广泛关注。新的ORIGIN研究证明胰岛素并没有致肿瘤的作用[2]，但是对二甲双胍抗肿瘤的作用目前仍没有统一说法[3]。2013年11月~2014年10月，本实验以体外培养的人子宫内膜癌Ishikawa 细胞作为研究对象，探讨不同浓度的二甲双胍对细胞增殖及雷帕霉素靶蛋白(mTOR)、DNA损伤反应调节基因(REDD1)表达的影响。

1材料与方法

1.1材料人子宫内膜癌Ishikawa 细胞购自南京凯基生物有限公司。RPMI1640培养基购于索莱宝科技有限公司；胎牛血清购于长城生物科技有限公司；二甲双胍由百时美施贵宝公司赠予；MTT试剂盒、Western blotting法试剂购于南京凯基生物科技有限公司；GAPDH鼠mAb、mTOR 兔 pAb、REDD1兔 pAb、山羊抗鼠 IgG、山羊抗兔 IgG购于proteintech公司；mTOR及REDD1扩增引物序列购于南京金斯瑞生物科技有限公司。

1.2细胞培养及药物干预Ishikawa细胞培养于RPMI1640培养基中，内含10%胎牛血清、青霉素100 U/mL、链霉素100 mg/L、谷氨酸盐2 mmol/L。37 ℃、5% CO2条件下2~3 d换液1次，达汇片后按5×105/瓶接种于25 cm2培养瓶。干预前用无血清RPMI1640洗2次，先用含0．1%牛血清白蛋白的无血清RPMI1640培养基培养48 h，进行分组，分别为二甲双胍1、5、10 mmol/L组和对照组(二甲双胍浓度为0 mmol/L)，以等体积无血清RPMI1640培养基替代二甲双胍进行干预。

1.3细胞增殖率的测算采用MTT法。收集对数期细胞，以5×103/孔接种于96孔板，每组设5个复孔，边缘孔用无菌PBS填充，37 ℃、5% CO2孵育。二甲双胍分别干预24、48、72 h后，每孔加入20 μL MTT溶液，继续培养4 h(注意避光)。终止培养，弃上清，每孔加入150 μL DMSO，置于摇床上低速振荡10 min。于波长490 nm处测量各孔的吸光度值。细胞增殖率=[(实验孔A值490-空白孔A值490)/(对照孔A值490-空白孔A值490)]×100%。

1.4细胞mTOR、REDD1 mRNA的检测采用RT-PCR法。按照TRIzol操作说明方法提取细胞总RNA。目的基因和内标基因GAPDH的反应均在ABI PRISM 7300 Fast Real-Time PCR System 上进行。mTOR扩增序列上游引物5′-CGCTGTCATCCCTTTATCG-3′,下游引物5′-ATGCTCAAACACCTCCACC-3′。REDD1扩增序列上游引物5′-TGGGCAAAGAACTACTGCG-3′, 下游引物5′-AGAGTTGGCGGAGCTAAACAG-3′。GAPDH扩增序列上游引物5′-CAGGGCTGCTTTTAACTCTGGT-3′，下游引物5′-GATTTTGGAGGGATCTCGCT-3′。PCR反应体系20 μL:Mix 10 μL，PCR Forward Primer(10 μm) 1 μL, PCR Reverse Primer(10 μm) 1 μL,cDNA样本 2 μL,RNageFree dH2O 6 μL。两步法PCR反应条件：37 ℃逆转录15 min，85 ℃、5 s；94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s；55 ℃退火 30 s；72 ℃延伸 30 s，33个循环；72 ℃总延伸 8 min。应用Image J软件进行分析。

1.5细胞mTOR、REDD1蛋白的检测采用Western blotting法。收集对数期的Ishikawa细胞，以2×105/孔接种于6 cm培养皿，不同浓度的二甲双胍作用48 h后收集细胞，提取细胞总蛋白，BCA蛋白测定试剂盒测定蛋白浓度。配制不同浓度的分离胶(GAPDH和REDD1用10%的分离胶，mTOR用8%的分离胶)，PBS调整蛋白浓度使之一致后加入蛋白上样缓冲液煮沸5~10 min，上样。进行SDS-PAGE凝胶电泳，浓缩胶电压80 V，分离胶电压120 V，电泳至溴酚蓝刚离开分离胶即终止电泳，根据蛋白相对分子质量Marker切胶，制成海绵垫、滤纸、目的凝胶、PVDF膜、滤纸、海绵垫“三明治”进行转膜，250 mA恒流转膜80 min。WB封闭液室温封闭1 h，加一抗稀释液4 ℃孵育过夜，加相应HRP标记的二抗

稀释液室温孵育1 h。滴加ECL发光试剂至PVDF膜表面，曝光、定影X线片后，应用Image J软件对X光片电泳条带斑点密度扫描的灰度值进行分析。

2结果

2.1各组不同时间细胞增殖率的比较不同浓度的二甲双胍干预人子宫内膜癌Ishikawa 细胞24、48、72 h后，细胞生长受到明显抑制，随着二甲双胍浓度的增加，细胞增殖率有降低的趋势，10 mmol /L的二甲双胍抑制细胞增殖作用最强(P均<0.05)。见表1。

表1　各组不同时间细胞增殖率的比较±s)

注：与对照组同时间比较，*P<0.05；与二甲双胍1 mmol/L组比较，#P<0.05；与二甲双胍5 mmol/L组比较，ΔP<0.05。

2.2各组REDD1、mTOR mRNA及蛋白表达的比较 见表2。

表2 　各组REDD1、mTOR mRNA及蛋白表达的比较

注：与对照组比较，*P<0.05；与二甲双胍1 mmol/L组比较，#P<0.05；与二甲双胍5 mmol/L组比较，ΔP<0.05。 3讨论

众所周知，糖尿病的发病率逐年增高，糖尿病与肿瘤之间的关系也成为研究热点。一些研究证实，乳腺癌、胰腺癌、结直肠癌、子宫内膜癌等恶性肿瘤在2型糖尿病患者中的风险增加，且死亡风险高于非糖尿病患者[4~7]。有研究表明，二甲双胍作为一种广泛的抗糖尿病药物，可以降低糖尿病患者的癌症发病率[8]，并在动物模型中抑制癌细胞增殖和肿瘤生长[9~11]。二甲双胍引起前列腺癌细胞周期G0~G1期阻滞，但并不会引起细胞凋亡或自噬[10]。在分子水平，二甲双胍调节AMP依赖的蛋白激酶(AMPK)/mTOR通路[12]。mTOR可以促进耗能的细胞进程并控制细胞生长。由于AMPK的激活抑制耗能通路和蛋白合成[13]，二甲双胍可以通过AMPK来抑制细胞增殖。相反，若下调AMPK并不会影响二甲双胍在前列腺癌细胞生长和mTOR通路抑制中的作用[10]。

REDD1(RTP801/Dig2/ DDIT4)被认为是低氧诱导因子1靶基因，参与细胞生长调节[14]。在缺氧环境下REDD1失活，细胞增殖增强，在一些肿瘤中REDD1下调[15]。REDD1是mTOR的负调节蛋白[16]，在调节mTOR和线粒体活性，抑制肿瘤发生的过程中起关键作用[17]，其与细胞凋亡有关[14]。有研究报道，二甲双胍可以增加REDD1的表达。

本研究结果提示,二甲双胍在体外可以抑制人子宫内膜癌细胞的增殖，且抑制程度随二甲双胍浓度增加、作用时间延长而呈增强趋势。二甲双胍能明显上调REDD1的表达，同时下调mTOR的表达。提示二甲双胍可能通过REDD1/mTOR信号通路抑制子宫内膜癌细胞增殖。

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(收稿日期：2015-06-23)

中图分类号：R737.33

文献标志码：A

文章编号：1002-266X(2016)01-0027-03

doi：10.3969/j.issn.1002-266X.2016.01.009

通信作者：赖晓阳(E-mail:laixyang60@sina.com)